小鼠NLRP3基因腺病毒干扰载体的构建及功能鉴定

目的构建针对小鼠NLRP3基因的腺病毒干扰载体(Ad-NLRP3-shRNA),并在Min6和RAW264.7细胞中验证其基因沉默效率。方法针对小鼠NLRP3基因设计、合成3对NLRP3 shRNA 1-3干扰序列,重组至pHBAd-U6-CMV质粒载体。在HEK293T细胞内包装Ad-NLRP3-shRNA。感染Min6和RAW264.7细胞后,采用实时定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测NLRP3基因表达。结果 Ad-NLRP3-shRNA 1-3在Min6和RAW264.7细胞的干扰效率分别达到44.38%、46.61%和82.83%以及47.23%、49.59%和78.64%。结论成功构建出Ad-NLRP3-shRNA载体,为研究NLRP3基因的功能提供有效工具。     

速生薄口螨休眠体的形态和分子特征鉴定

目的 通过形态和分子特征鉴定速生薄口螨休眠体。方法 从采集到的生姜样本中分离出速生薄口螨休眠体,分别在光镜和扫描电镜下观察其外部形态和超微形态并进行拍照鉴定。同时提取基因组DNA对cox1和ITS基因进行测序和分析。结果 速生薄口螨休眠体足4对,背面躯体呈扁平状,表皮骨化,前足体呈三角状,足三表皮内突相连,形成一条拱线,分隔开胸板和腹板。足爪和前跗节发达,有刚毛附着,躯体末端吸盘板发达,板上有八个吸盘呈2-4-2分布。经PCR扩增得到cox1基因片段大小为487 bp,ITS全序列长度为1667 bp。结论 根据光镜和电镜下速生薄口螨休眠体的形态,结合cox1和ITS基因序列,为速生薄口螨休眠体的鉴定和生物学分类提供了依据,也可为控制速生薄口螨及其引起的过敏性疾病奠定基础。     

RNA干扰在破骨细胞分子调控应用的研究进展

骨质疏松症及其相关骨疾病由成骨细胞和破骨细胞比例失调造成的,导致骨折,致使平均寿命预期降低,迫切需要新的治疗方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种序列特异性转录后基因沉默技术,可用于调控蛋白质的表达,目前被用作阐明疾病相关基因的工具。破骨细胞是一类由骨髓造血干细胞来源的多核巨细胞,其主要作用是介导骨组织的吸收。目前对破骨细胞生物学特性、分化调控机制以及相关通路的研究比较多,但是关于RNAi在破骨细胞分子调控方面的研究尚缺乏。本文就RNAi在破骨细胞分子调控应用方面的研究作相关综述分析,介绍RNAi技术敲除过度骨吸收的多种分子靶标,为科研使用RNAi对破骨细胞的研究提供参考,以期更好地发展靶向的治疗策略。     

Survivin-shRNA对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞自噬及凋亡的影响

目的:研究Survivin-shRNA对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞自噬及凋亡的影响。方法:培养视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，构建Survivin-shRNA载体。按照处理不同分为Survivin-shRNA组、GFP组和CON组。分别采用流式细胞术检测Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞凋亡和细胞周期的影响，应用MTT法检测Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞活性的影响，Western blot法检测Survivin-shRNA对HXO-RB44 细胞自噬相关蛋白LC3、p62 与mTOR 表达的影响。结果:流式细胞术结果表明，与Control组和GFP组相比，Survivin-shRNA组细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着作用时间的延长，S期出现阻滞，48 h阻滞最强，显著高于对照组（P＜0.05）。MTT结果发现Survivin-shRNA可抑制HXO-RB44细胞增殖活性，与Control组和GFP组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot结果发现，与对照组相比，LC3表达量显著增加（P＜0.01）；而mTOR表达量降低（P＜0.01）。结论:Survivin-shRNA可促进视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞的凋亡和自噬水平，进而特异性杀伤肿瘤细胞。     

lncRNA uc.48+对2型糖尿病大鼠肝糖原的影响

目的探讨长非编码核糖核酸uc.48+小干扰RNA(lncRNA uc.48+siRNA)对2型糖尿病大鼠肝糖原异常的影响及可能机制。方法采用高糖高脂饲料喂养及链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,造模成功后,lncRNA uc.48+siRNA尾静脉注射至大鼠体内,动态监测血糖变化及注射1周后检测肝糖原含量;蛋白印迹及qPCR检测各组大鼠肝脏组织中葡萄糖激酶(glucokinase,GK)mRNA和蛋白表达变化。结果糖尿病模型大鼠用uc.48+小干扰RNA处理后,餐后血糖、空腹血糖较模型大鼠降低。肝糖原检测显示,糖尿病模型组大鼠肝糖原较对照组明显降低,糖尿病模型大鼠加uc.48+小干扰RNA处理后,肝糖原的合成较糖尿病模型组大鼠增多。糖尿病模型组肝脏GK mRNA和蛋白表达较对照组明显减少,经uc.48+小干扰RNA干预后,肝脏GK的mRNA与蛋白表达较糖尿病模型组明显增加。结论 uc.48+小干扰RNA可降低2型糖尿病模型大鼠升高的血糖,增加肝糖原合成,其机制涉及增加GK及磷酸化Akt1表达。     

HOXA13 在非小细胞肺癌组织中的表达及其对A549 细胞和移植瘤生长的影响

[摘要] 目的：探讨HOXA13 在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中的表达及沉默HOXA13 基因表达对A549 细胞和移植瘤生长的影响。方法：收集2014 年3 月至2016 年4 月在焦作煤业集团有限责任公司中央医院胸外科接受手术切除治疗的112 例NSCLC癌组织和相对应的癌旁组织。qPCR实验检测NSCLC癌和癌旁组织中HOXA13 表达。培养A549 细胞并分为siRNA-HOXA13 组、阴性对照组和对照组，qPCR实验检测A549 细胞中HOXA13 表达，CCK-8 法检测细胞增殖能力，Transwell法检测细胞侵袭能力。建立裸鼠移植瘤模型，观察裸鼠生长情况，5 周后处死，称瘤体质量并计算抑瘤率；qPCR实验检测瘤体组织中HOXA13 表达水平。结果：NSCLC 癌组织中HOXA13 mRNA相对表达量明显高于癌旁组织（1.83±0.13 vs 1.12±0.10，t=47.008，P=0.000），其相对表达量与TNM 分期、分化程度和淋巴结转移相关（P<0.05）。siRNA-HOXA13 组细胞中HOXA13 mRNA相对表达量低于阴性对照组和对照组（均P<0.05）；siRNA-HOXA13 组24、48、72、96 h 时细胞增殖水平（D值）明显低于阴性对照组和对照组（F=30.727、5.427、13.816 和24.454，均P<0.05 或P<0.01）；siRNA-HOXA13 组侵袭细胞数低于阴性对照组和对照组（均P<0.05）；siRNA-HOXA13 组裸鼠移植瘤5 周时瘤体质量小于阴性对照组和对照组，而抑瘤率高于阴性对照组（均P<0.05）；siRNA-HOXA13 组裸鼠移植瘤组织中HOXA13 mRNA相对表达量低于阴性对照组和对照组（均P<0.01）。结论：NSCLC癌组织中HOXA13 呈高表达，且与肿瘤发生、进展及转移有关；特异性沉默HOXA13 基因表达可抑制细胞增殖和侵袭力，并抑制裸鼠移植瘤生长。     

全氟类化合物在人体与动物体内的生殖毒性

全氟类化合物（polyfluorinated chemicals，PFCs）是一类来自工业生产，存在于人们日常生活环境中内分泌干扰物（endocrine disruptors，EDCs）。研究表明，PFCs可以聚集在生物体内，并通过影响甾体激素合成、诱导生殖系统细胞凋亡、拮抗激素受体等机制，在生殖系统表现出毒性作用。在男性中，这类物质被证明与精子的质量与数量的下降及异常精子比率的上调有关，干扰男性性激素水平（如睾酮）；而在女性中也发现血液或卵泡液中PFCs水平的升高，往往伴随着性激素及促性腺激素（如雌孕激素，卵泡刺激素等）水平的异常以及生育力的下降，这类物质在孕期的暴露甚至有影响至下一代的可能。此外，已有动物实验从分子层面对这类物质的毒性机制进行了证实，因此PFCs的生殖毒性值得关注。     

HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统，并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA，以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体，酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞，以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞，通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组（NEG-shRNA）、干扰组（shRNA-HSP90β）、过表达NC对照组（NEG-pEZ）及过表达组（pEZ-HSP90β）。通过qRT-PCR 与Western blotting 分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后，嘌呤霉素最小致死浓度1 μg/ml，感染复数200，感染人Saos-2的感染效率达80%，其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%，pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2.8倍。进一步研究发现，shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低，pEZ-HSP90β组较NEG-pEZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功，并能够在Saos-2中稳定表达。