16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法。方法利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析。结果应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化。确定双重PCR最佳退火温度为52℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280bp和183～192bp;杂交温度32℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1min,16种分枝杆菌的杂交效果最好,特异性达100%。结论用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌。     

焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性

目的 利用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星的耐药性,并对其临床应用进行评价.方法 收集上海市肺科医院2008-2009年临床确诊的肺结核患者的痰标本培养阳性结核分枝杆菌89株.所有菌株按<结核病诊断实验室检验规程>进行分枝杆菌培养、菌种鉴定.另外10株已知药敏结果的结核分枝杆菌来自上海市肺科医院菌株库.利用焦磷酸测序技术,以10株已知药敏结果和经直接测序已知耐药基因突变情况的结核分枝杆菌为试验菌株,探索焦磷酸测序检测结核分枝杆菌rpoB、katG、gyrA、rrs耐药基因的最佳模式,并用该条件检测89株结核分枝杆菌临床分离株,检测结果与Bactec 960药敏法进行比较.结果 rpoB、gyrA基因检测宜采用焦磷酸测序序列分析模式,katG、rrs基因检测宜采用焦磷酸测序单核苷酸多态性模式.以Bactec 960药敏法测定结果为判断标准,则焦磷酸测序法检测89株结核分枝杆菌临床分离株对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性的敏感度分别为98.0%、64.1%、79.5%、78.3%,特异度分别为97.5%、100.0%、90.0%、100.0%,准确性分别为97.8%、77.5%、85.4%、94.4%,该法检测利福平、氧氟沙星、阿米卡星的检测结果与Bactec 960药敏检测结果一致性较好,Kappa值均≥0.7.结论 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性具有快速、准确、高通量的优点,是一种可对结核分枝杆菌多种药物耐药性进行快速检测的方法.

Abstract：

Objective To develop an assay to determine Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin by pyrosequencing and evaluate the value of this method in clinical application. Methods Eighty-nine clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from tuberculosis patients were collected from Shanghai Pulmonary Hospital during 2008 to 2009. All strains were isolated from decontaminated sputum, cultured on Lowenstein-Jensen media and identified by traditional biochemical tests with standard methods. Ten Mycobacterium tuberculosis were selected from the strain bank of Shanghai Pulmonary Hospital. The optimal conditions of detection of rpoB, katG, gyrA and rrs gene by pyroseuencing were determined, using the 10 Mycobacterium tuberculosis strains whose drug susceptibility of Bactec 960 and sequence of rpoB, katG, gyrA, rrs gene were known. Then the drug susceptibility of 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolate strains were detected by pyrosequencing using this conditions and the results were compared with that of the Bactec 960 methods. Results The pyrosequencing program of sequence analysis was suitable for the detection of the mutations of rpoB and gyrA genes, and the program of single nucleotide polymorphism was suitable for katG and rrs genes. Among the 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolates,when using the drug susceptibility of Bactec 960 as the standard, the sensitivity of rifampin, isoniazid,ofloxacin and amikacin is 98.0%, 64. 1%, 79.5%, 78. 3% respectively, the specificity is 97.5%,100. 0%, 90. 0%, 100. 0% respectively, the accuracy is 97.8%, 77. 5%, 85.4%, 94. 4% respectively,tested by pyrosequencing. The results of the detection of resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin in Mycobacterium tuberculosis using pyrosequencing technique were almost the same with that of Bactec 960, and Kappa ≥0. 7 in each detection. Conclusion Pyrosequencing is thus a rapid, accurate and high throughput method for detecting Mycobacterium tuberculosis resistance to these four drugs.     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐药性

随着耐药结核病患者的不断增加,氧氟沙星(Ofloxacin,OFLK)等氟喹诺酮类抗结核分枝杆菌MTB的药物被广泛应用,对OFLX的耐药呈上升趋势.早期检测OFLX的耐药性对临床用药具有指导作用.氟喹诺酮类药物主要作用靶位是菌体的DNA解旋酶,该酶由gyrA和gyrB基因分别编码的A和B亚基组成.     

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法.方法 体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的"三明治"夹心法对获得的适配子进行初步验证.将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定最佳阳性判定值,并构建散点图.结果 经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492～1.243,73.3％的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;"三明治"夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7％,阳性组标本的阳性检出率为87.9％,表现出一定的检测价值.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子.     

金标试纸在街头无偿献血工作中发挥的作用

随着无偿献血事业的发展和街头采血室的出现,如何降低血液报废率、降低检测成本成为日益重要的问题。为此,我们采用金标试纸对无偿献血者进行初筛,现将结果分析如下:1 材料与方法1.1 检测对象 2001年10月1日~2003年10月1日,前     

分枝杆菌简单序列重复区间分型方法的研究

目的 构建分枝杆菌简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)分型系统,为结核分枝杆菌的基因分型、菌种鉴定以及流行病学的研究提供新的研究工具和研究思路.方法 根据结核分枝杆菌基因组中简单重复序列(SSR)的丰度和频率,设计用于分枝杆菌基因分型的ISSR引物,以分枝杆菌属的DNA为材料,分析DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响,构建分枝杆菌的ISSR分型体系,并通过该体系筛选获得扩增结果稳定、多态性强的引物.结果 经过优化实验建立了分枝杆菌ISSR-PCR最佳反应体系,20 μl的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:10 ng模板DNA,1 U Taq酶,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTPs.利用该反应体系从10个ISSR引物中,筛选出了3个稳定性高、重复性好的引物,对分枝杆菌属28个菌种的标准菌株及52株结核分枝杆菌临床分离株进行了ISSR遗传多样性分析.结果 显示,28个分枝杆菌菌种,除了结核和牛分枝杆菌之间具有较高的相似性,两两之间存在着高度的遗传多样性;52株结核分枝杆菌菌株在用ISSR进行分型时,大部分菌株表现出了较高的遗传相似性.结论 建立了分枝杆菌属的ISSR分型体系.     

尼卡地平对高血压脑出血患者血清sCysC、血肌酐、血乳酸、血钙水平的调控及急性肾损伤的预防效果

【摘要】 目的：探究尼卡地平对高血压脑出血（HICH）患者血清（sCysC）、血肌酐（Scr）、血乳酸（Lac）、血钙（Ca2+）水平的调控及急性肾损伤（AKI）的预防效果。方法：选取我院2017年1月～2018年1月收治的HICH患者150例为研究对象,按照随机数字表法分为观察组与对照组,各75例。其中对照组行乌拉地尔降压治疗,观察组行尼卡地平治疗。比较两组AKI发生率及sCysC、Scr、Lac、Ca2+水平差异,并分析sCysC、Scr、Lac、Ca2+对AKI的预测价值。 结果：治疗2周后,两组血清sCysC、Scr、Lac均呈降低趋势,Ca2+水平升高,且观察组sCysC、Scr、Lac水平低于对照组（P<0.05）,Ca2+水平高于对照组（P<0.05）。150例HICH患者出现AKI 16例（10.67%）,未发生AKI 134例（89.33%）。且观察组患者AKI的发生率为4.00%,低于对照组的17.33%,差异具有统计学意义（P<0.05）,但两组并发症总发生率差异无统计学意义（P>0.05）。二元Logistic回归分析显示,APACHEⅡ评分、sCysC、Scr、Lac均为HICH患者AKI发生的危险因素（P<0.05）,Ca2+为HICH患者AKI发生的保护因素（OR=0.016,P<0.05）。ROC曲线分析显示,血清sCysC、Scr、Lac、Ca2+水平对HICH患者AKI预后具有一定的价值（AUC=0.932、0.840、0.833、0.886）。结论：尼卡地平对HICH患者的治疗效果肯定,其可降低AKI发生率,改善患者预后;且sCysC、Scr、Lac、Ca2+水平对HICH患者AKI发生具有一定的诊断价值。     

显色法芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

 目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法。 方法 根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的分枝杆菌 16S rDNA 基因的保守区和突变区（第 129 ~ 267 位核苷酸的 A 突变区、第 430 ~ 500 位核苷酸的 B 突变区）分别设计引物和寡核苷酸探针，用地高辛标记引物并制备玻璃芯片。采用双重 PCR 技术分别对 16 种分枝杆菌标准株、5 种非分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株（非结核分枝杆菌 40 株、结核分枝杆菌复合群 80 株）进行扩增，扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测，尼龙膜显色，以显现蓝黑色斑点作为阳性信号，并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类。根据芯片杂交结果，选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行 DNA 测序。 结果 16 种分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株经 PCR 扩增均各产生 2 条 DNA 片段，其中 1 条长度为 272 ~ 280 bp，1 条长度为 183 ~ 192 bp。16 种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交，应用显色法芯片技术分析 16 种分枝杆菌标准株和 5 种非分枝杆菌标准株的特异性为 100%。120 株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针 a 杂交，其中 79 株确定为结核分枝杆菌复合群，38 株确定为非结核分枝杆菌（不产色分枝杆菌 17 株，胞内分枝杆菌 8 株，猿猴分支杆菌 6 株，瘰疬分枝杆菌 5 株，偶然分支杆菌 2 株），另 3 株只与分枝杆菌属探针 a 杂交，没有鉴定到种。选取的 26 株分枝杆菌临床分离株（结核分枝杆菌复合群 8 株，不产色分枝杆菌 5 株，胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各 3 株，瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各 2 株）DNA 测序显示，未鉴定到种的 3 株分枝杆菌中，1 株为结核分枝杆菌突变株，1 株为 Mycobacterium lentiflavum，1 株为 Mycobacterium arupense，芯片上无后 2 种菌株的特异性探针；其余 23 株菌株测序结果与芯片检测结果一致。 结论 显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，具有一定的临床推广应用价值。     

自体骨粉种植免除二期颅骨修补术后护理

自体骨粉种植免除二期颅骨修补是近几年才开展的新项目 ,手术后护理对确保手术成功起着关键重要的作用。1992～ 1995年 ,我科对开颅去骨板减压术的患者于手术结束前用自体骨粉种植于创面 ,生存 2 3例 ,只有 3例因额部成形差 ,凹陷明显而影响美观的患者需行二期颅骨修补外 ,其余 2 0例无需行颅骨修补术 ,现将护理经验总结如下。1　临床资料　　一般资料 :本组 2 3例 ,男 14例 ,女 9例 ,年龄 6～ 6 8岁。以重型颅脑损伤患者为主 19例 ,其余的有高血压脑出血、 AVM出血各 2例 ,均为单纯去骨板减压术者 ,其中以颞顶额部去骨板减压术为主 ,17例…     

96例开颅术后留置管预防感染

目的 预防开颅术后留置引流管感染。方法 开颅患者采取术中使用抗生素预防,术后各个环节都按无菌原则操作,对病情加强观察,提高医护人员感染意识,发现问题及时采取有效措施,保持室内空气清闲,合理使用抗生素。结果 96例开颅术后留置引流管进行监测,除2例经取材培养为表皮葡萄球菌外,其余为无菌生长。结论 在预防措施中取得了较满意的效果。