结核分枝杆菌潜伏性感染相关抗原的研究进展

结核病（Tuberculosis， TB）是由结核分枝杆菌（Mycobac-terium tuberculosis， Mtb）感染引起的传染性疾病。全世界范围内约1／3的人为结核分枝杆菌潜伏性感染（ latent TB infec-tion， LTBI），其中10％的LTBI感染者最终会发展为活动性结核［1］。 LTBI感染者体内的Mtb通常以休眠菌的形式存在巨噬细胞内，通过改变自身特征和代谢途径适应宿主体内环境长期存活于人体内。休眠的Mtb在宿主免疫力下降时被激活、增殖、播散，最终发展为活动性结核［2］。潜伏感染不是简单的细菌暂停生长状态，而是与宿主免疫系统的动态平衡。至少有3个系统参与其中：休眠调节系统、Mtb再激活系统、毒素-抗毒素系统（ toxin-antitoxin system， TAS）［3］。潜伏感染相关抗原的发现为潜伏感染诊疗提供了坚实的理论依据及广阔的应用潜力。现将 Mtb潜伏感染相关抗原的研究进展综述如下。     

盐酸戊乙奎醚治疗有机磷农药中毒观察

目的:观察盐酸戊乙奎醚(长托宁)治疗有机磷农药中毒的疗效。方法:将100例有机磷农药中毒患者分为治疗组和对照组,在基本治疗基础上治疗组给予长托宁治疗,对照组给予阿托品治疗。结果:长托宁用药次数明显少于阿托品,疗效确切,住院天数明显缩短,不良反应少。结论:长托宁治疗有机磷农药中毒优于阿托品。     

穿心莲内酯对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞表达的影响及其作用机制

目的：穿心莲内酯是中药穿心莲的主要有效成分,在体内外均具有较强的抗炎作用。该研究观察穿心莲内酯对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞、eotaxin及IL-5表达的影响。方法：32只BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组、布地奈德组、穿心莲内酯组,每组8只。以卵清蛋白（OVA）致敏激发建立哮喘小鼠模型。ELISA法检测BALF及外周血中eotaxin、IL-5的水平,实时荧光定量PCR法检测肺组织eotaxin、IL-5 mRNA的表达。结果：穿心莲内酯明显抑制哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞（P0.05）。结论：穿心莲内酯通过降低哮喘小鼠eotaxin、IL-5的表达,抑制哮喘气道嗜酸性粒细胞浸润。     

腹腔镜手术治疗区域型肝胆管结石病的临床效果评价

目的：探讨腹腔镜手术治疗区域型肝胆管结石病的临床效果。方法按照入院顺序抽签后将52例区域型肝胆管结石病患者分为试验组和对照组,试验组患者行腹腔镜手术治疗,对照组患者行传统开腹手术治疗。对比2组患者治疗情况、结石清除效果及术后并发症的发生情况。结果试验组患者平均手术时间、术中平均出血量、术后平均住院时间均明显低于对照组,其有统计学差异（P<0.05）;2组患者结石完全清除率对比无统计学差异（P>0.05）;试验组患者术后并发症发生率明显低于对照组,有统计学差异（P<0.05）。结论腹腔镜手术治疗区域型肝胆管结石病临床效果确切,创伤小,恢复快,术后并发症发生少,值得临床推广。     

黏膜免疫壳聚糖-多胺转运蛋白D(PotD)DNA纳米微粒对小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植的保护作用研究

Objective To prepare the chitosan-potD nanoparticles and to evaluate its protective efficacy against pneumococcal nasopharyngeal colonization. Methods potD gene was amplificated from pneumococcal genome and was inserted into pVAX1 expression vectors to construct pVAX1-potD recombinant plasmid which was then transfected into 293T cell using LipofectAMINE 2000 to analyze transient potD gene expression in vitro by RT-PCR and Western blot. Chitosan-potD nanoparticles were freshly prepared by coacervation methods at each time and the characterizations of the nanoparticles were then evaluated. BALB/c mice were immunized with chitosan-potD, naked potD DNA or pVAX1 for 4 times at two-week intervals. Anti-PotD IgG, IgG1 and IgG2a levels in serum and IgA levels in nasal washes, bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and middle ear lavages(MEL) were detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). IL-17A, IL-4 and IFN-γ levels in splenocytes were determined by double sandwich ELISA. Mice were intrannsally challenged with Streptococcus pneumoniae ATCC6303, and Pneumococci were recovered from the nasopharyngeal niche at the fifth day after challenge. Results potD gene was successfully amplificated by PCR and the sequence was confimed to be consistent with that in the Genbank. The pVAX1-potD recombinant plasmid was successfully constructed and was expressed in eukaryocytes in vitro. The mean size and zeta potential of chitosan-potD nanoparticles was 430 nm and + 20.5 mv, respectively. Chitosan-potD nanoparticles were not digested by DNase Ⅰ , while naked potD DNA was completely digested. The levels of antibodies inculding IgG, IgG1, IgG2a, IgA and cytokines including IL-17A, IL-4 and IFN-γ were significantly higher in mice immunized with chitosan-potD nanoparticles than mice with naked potD or pVAX1 ( P <0.05) only. More importantly, much less Pneumococci were recovered from mice immunized with chitosan-potD nanoparticles than the other groups(P <0.05). Conclusion Chitosan-potD nanoparticles significantly enhanced the immunogenicity and protection efficacy of DNA vaccines by intranasal immunization and could be used as a potential mucosal vaccine to prevent pneumococcal infection.     

黏膜免疫壳聚糖-多胺转运蛋白D(PotD)DNA纳米微粒对小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植的保护作用研究

目的 探讨以壳聚糖包裹的PotD DNA(Chitosan-potD)纳米微粒经鼻黏膜免疫小鼠对肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.方法 将制备的Chitosan-potD微粒、裸pVAX1-potD重组质粒(裸potD)及pVAX1分别鼻腔免疫小鼠,收集黏膜和血清标本用以检测特异性抗体水平;分离并培养脾淋巴细胞,检测IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;于免疫小鼠鼻腔进行肺炎链球菌攻击,通过菌落计数评估各免疫组对小鼠肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.结果 Chilosan-potD纳米微粒在小鼠体内诱导产生的抗PotD特异性血清IgG、IgG1、IgG2a、黏膜IgA抗体水平及IL-17A、IL-4、IFN-γ水平与裸potD组及pVAX1组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);菌落计数结果 显示,Chitosan-potD微粒组在鼻咽部定植的肺炎链球菌数量显著减少(P<0.05).结论 壳聚糖包裹PotD DNA微粒对肺炎链球菌鼻咽部定植具有免疫保护作用.     

小鼠肺炎链球菌psaA核酸疫苗的制备及其初免-蛋白加强免疫策略的研究

白加强免疫1次,对照组5只小鼠经pVAX1空载体免疫3次后,生理盐水加强免疫1次,分别采集血清测定两组抗PsaA抗体水平.结果 成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆;所构建的psaA核酸疫苗序列正确,同时实现了PsaA蛋白的一步亲和纯化;psaA核酸疫苗可在293T真核细胞中成功表达;核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度高于对照组(t=87.518,P＜0.05).结论 成功构建出psaA核酸疫苗,采用核酸疫苗初免-蛋白加强免疫策略能增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性.     

小鼠肺炎链球菌psaA核酸疫苗的制备及其初免-蛋白加强免疫策略的研究

白加强免疫1次,对照组5只小鼠经pVAX1空载体免疫3次后,生理盐水加强免疫1次,分别采集血清测定两组抗PsaA抗体水平.结果 成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆;所构建的psaA核酸疫苗序列正确,同时实现了PsaA蛋白的一步亲和纯化;psaA核酸疫苗可在293T真核细胞中成功表达;核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度高于对照组(t=87.518,P＜0.05).结论 成功构建出psaA核酸疫苗,采用核酸疫苗初免-蛋白加强免疫策略能增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性.     

分枝杆菌同源可控表达系统的建立及其应用

目的 构建分枝杆菌可控表达载体,利用其过表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tu-berculosis,Mtb)的免疫保护性抗原,亲和层析纯化后分析免疫原性.方法 应用PCR扩增耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)乙酰胺酶编码基因启动子(pACE),构建分枝杆菌可控表达载体pMF系列;克隆Mtb嵌合抗原编码基因并用乙酰胺进行诱导表达,以Ni~(2+)亲和层析纯化重组蛋白;并用该重组嵌合抗原Ag856A2对卡介苗(BCG)免疫的小鼠脾细胞进行体外刺激,以IFN-γ酶联免疫斑点技术(ELISPOT)分析其免疫原性.结果 成功构建了分枝杆菌可控表达载体pMF系列,利用0.02%乙酰胺进行诱导可实现目标抗原在Ms中的高水平表达;同时利用引入的6×His标签可方便实现重组抗原的一步纯化,且该同源表达重组抗原可诱导更高水平IFN-γ的分泌.结论 以Ms乙酰胺酶编码基因启动子pACE为基础构建的分枝杆菌可控表达系统可实现Mtb抗原在Ms中的高水平表达与纯化,与大肠杆萧异源表达相比,该同源表达重组抗原具有更好的免疫原性.     

气雾攻击法感染结核病小鼠模型的建立及其综合评价

目的模拟自然感染方式建立结核病小鼠模型,并对其病理变化进行综合评价。方法通过气雾攻击方式将结核分枝杆菌H37Rv接种至C57BL/6J小鼠体内。在感染后的4周、6周、8周对小鼠进行micro-CT活体动态扫描,无菌分离肺脏和脾脏,肉眼观察病变情况,活菌菌落计数,组织病理检测(HE和抗酸染色)。结果肉眼观察和micro-CT扫描发现,不同时间小鼠肺部感染情况逐渐加重,至感染后第8周时病变弥漫至整个肺部；HE染色肺组织出现弥漫性肉芽肿样实变；抗酸染色可见结核分枝杆菌。结论通过大体病变、病理、影像、菌落计数几个方面对建立的小鼠模型进行综合分析,证明利用气雾攻击法感染的结核病小鼠模型建立成功；该模型在形成病变时与结核患者的情况存在一定差异,对其完善的综合评价有助于在相关研究中对该小鼠模型的合理应用。