不同保存温度对SE-9000型血液分析仪检测外周造血干细胞稳定性的影响

目的探讨不同条件下保存的血液对外周造血干细胞检测的影响。方法以SE-9000型血液分析仪检测不同温度、不同时间保存的血液外周造血干细胞的数量和百分率。结果4°C条件下保存12 h内造血干细胞的数量和百分率结果无明显变化;20°C条件下保存8 h内造血干细胞的数量和百分率结果无明显变化;而30°C条件下保存6 h内造血干细胞的数量和百分率无明显变化。结论血液样本在4~30°C条件下保存6 h对SE-9000型血液分析仪检测外周造血干细胞无影响。     

超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较

目的对超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞上清外泌体优缺点进行比较,为外泌体相关基础实验研究及临床检测提供方法学参考。方法收集前列腺癌细胞上清分别用两种方法提取外泌体,进行电镜鉴定、BCA定量测定蛋白浓度、Western blot检测标志蛋白以及Zetaview颗粒粒径、浓度及电势分析,比较两种方法提取外泌体的优缺点。结果电镜下两种方法均可观察到具有膜结构的典型的类似于茶托状结构的外泌体,但膜亲和柱法提取外泌体背景中有类似蛋白聚合物等杂质的存在,超离背景纯净,每个视野下的外泌体数量要明显多于QIAGEN膜亲和柱法;Western blot测定标志蛋白,根据BCA定量同等上样量超速离心法可观察到明显的β-actin,ALIX,CD63以及EGFR条带,而QIAGEN膜亲和柱法仅可观察到β-actin,ALIX以及EGFR条带,但均较超速离心法条带弱;Zetaview粒径分析,超速离心法粒径分布峰值为116 nm,膜亲和柱法提取外泌体分布峰值为122 nm,均符合外泌体的粒径分布范围;电势分析两者均为负值,符合外泌体的电势分布;而颗粒数与蛋白浓度比值超速离心法提取外泌体要高于QIAGEN膜亲和柱法(t=13.47,P0.01)。结论超速离心法与膜亲和柱法均可以从细胞上清中提取外泌体,超速离心法步骤繁琐,时间较长,但外泌体纯度高,杂质少,BCA蛋白定量与实际所含外泌体蛋白量基本一致;QIAGEN膜亲和柱法方法简单,可快速从细胞上清中提取到外泌体,但纯度不及超速离心法,BCA蛋白定量比实际所含外泌体蛋白量要高,超速离心法适用于外泌体的各方面研究,而QIAGEN膜亲和柱法由于有杂蛋白的污染,因此更适用于外泌体核酸分析相关研究。     

快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究

目的 应用多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析（multiple—Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation Polymorphism，multi—PCR—SSCP）方法，快速、特异地同时检出耐异烟肼（isoniazid，INH）结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况，并与直接测序（derictsequencing，DS）结果相比较，参照药敏试验，探讨该方法的可行性。 方法 根据结核分支杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR-SSCP技术，同时检测对结核分支杆菌耐INH起作用的这三个基因的突变情况；同时进行耐药株的测序分析。 结果 对H37Rv标准株、临床分离INH敏感株（23株）及INH耐药株（35株）进行multi—PCR—SSCP分析，突变检出率82．9％（29／35）；耐药株测序分析突变检出率为85．7（30／35）。两种方法的符合率为97．1％E（29＋5／）／35]。 结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索，multi—PCR—SSCP方法敏感、特异，能同时快速有效地检测结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG三个INH耐药基因的突变，提高检验效率，有望成为临床指导用药的好方法。     

血清胃蛋白酶原、促胃液素对胃癌的诊断价值

目的研究血清胃蛋白酶原Ⅰ(PG I)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)及促胃液素(GS)与胃癌发生的关系,探讨检验血清PGⅠ,PGⅡ,GS对胃癌的诊断价值。方法采用免疫放射分析法(IRMA)和放射免疫分析法(R IMA)检测36例胃癌患者、23例胃良性病、11例萎缩性胃炎和34例正常人血清蛋白酶原、促胃液素水平并进行比较。结果胃癌患者血清PGⅠ,PGⅡ的水平显著低于胃良性病和正常人组(P<0.05),而血清GS水平显著高于胃良性病和正常人组(P<0.05),其中不同分化程度间差异不明显(P>0.05),术后血清PGⅠ,PGⅡ,GS水平显著低于术前水平(P<0.05),复发组的水平显著高于术后未复发组(P<0.05)。结论检测血清PGⅠ,PGⅡ,GS对胃癌的诊断及区别胃良性病具有较高的临床价值。     

通过 CRISPR/Cas9 技术抑制 TFDP3 基因对前列腺癌 PC3 细胞生物学功能的影响

[ 摘 要 ] 目的：通过 CRISPR/Cas9 技术构建前列腺癌 PC3 细胞 TFDP3 基因敲除的稳转株,探讨抑制 TFDP3 表达对 PC3 细 胞周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法：通过生物信息学筛选 sgRNA,通过 CRISPR/Cas9 技术、构建抑制 TFDP3 基因表达 的 sgRNA-Cas9 共转染慢病毒,感染 PC3 细胞后筛选获取稳转细胞株。通过流式细胞术对 TFDP3 基因敲除（knock-out,KO） 实验组与空白对照组进行细胞周期和凋亡检测,并进一步通过划痕实验和 Transwell 实验进行细胞迁移和侵袭能力检测。 结果：通过生物信息学筛选获得 3 条 sgRNA,其中 sgRNA2 有明显的抑制前列腺癌细胞基因表达的功能;通过 CRISPR/ Cas9 技术成功构建了基于 CRISPR/Cas9 介导的 TFDP3 低表达的 PC3 细胞稳转株。抑制 TFDP3 基因表达后,相比于对照组, KO 组中 G0/G1 期细胞百分比增加、G2/M 期细胞百分比下降（P<0.05 或 P<0.01）,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）,细胞迁移率 明显下降 [24 h 迁移率：(44.00±1.60)% vs (65.00±4.40)%,P<0.01],穿过聚碳酸酯膜的侵袭细胞数明显下降 [（185.89±11.71）vs （248.33±11.95）个,P<0.01]。结论：通过 CRISPR/Cas9 技术抑制 TFDP3 基因表达后,PC3 细胞发生周期阻滞、凋亡率也有所增 加、迁移和侵袭能力显著减弱,提示 TFDP3 是一个前列腺癌促癌基因。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

一次性针眼贴在婴幼儿头皮静脉采血按压中的应用效果研究

目的探讨一次性针眼贴在婴幼儿头皮静脉采血按压中的应用效果。方法将600例接受头皮静脉穿刺采血的患儿分为对照组和试验组,每组各300例。对照组采血后用棉签顺血管走向纵向按压3~5min。试验组采血后用一次性针眼贴敷贴采血处,两指并拢按压3~5min。比较两组患儿按压效果。结果试验组按压效果优于对照组,不良反应发生例数小于对照组,患儿家属满意度高于对照组(P0.05)。结论采用一次性针眼贴按压,可增加按压面积,避免按压移位,减少采血后不良反应的发生,不仅有利于保护患儿血管,也提高患儿家属满意度,值得推广应用。     

血浆脑钠肽水平对冠心病诊断价值的初步探讨

目的通过检测观察冠心病患者血浆中脑钠肽(BNP)水平的改变,并与其肌钙蛋白I(cT n I)水平和高敏感性C反应蛋白(hs CRP)水平变化相比较,初步探讨将BNP作为冠心病临床诊断和治疗的标志物的可靠性。方法2004年3~11月,以分层随机抽样法获取西安地区健康人群血浆样本195份(男性132名,女性63名),西京医院住院患者血浆279份(包括129名冠心病、60名糖尿病、62名肺病疾患、28名单纯眼部疾患),利用微粒子酶免分析法和动态定时散射比浊法分别检测上述血浆BNP浓度、cT n I浓度及hs CRP浓度;将以上数据进行统计学分析,比较冠心病组与非冠心病组的差异显著性。结果统计学分析证实:冠心病组与正常组在BNP水平、cT n I水平及hs CRP水平上均存在非常显著性差异(P<0.01),而其中又以BNP水平差异显著性最大(P=0.001);糖尿病组、肺病组以及眼科阴性对照组的BNP浓度结果与正常组比较则显示无统计学意义(P>0.05)。结论血浆BNP浓度在冠心病患者中显著升高,进一步显示了其在心脏疾患中潜在的临床价值。     

SDS-琼脂糖凝胶电泳分析蛋白尿来源的临床意义

目的分析尿蛋白成分来鉴别蛋白尿来源。方法应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶进行非浓缩尿蛋白电泳分析49例蛋白尿患者的尿蛋白成分。结果在肾后性蛋白尿中往往可以检测到巨球蛋白等一类大分子蛋白,而在肾性则往往缺乏。并且以巨球蛋白作为鉴别蛋白尿的标准,其敏感性和特异性均达到95.8%。结论该方法客观性强,诊断符合率高,重复性好,简便快速,值得临床应用。     

2种HBsAg定量检测系统对HBV不同感染阶段及不同基因型样本检测的一致性评价

目的分析罗氏MODULAR E170电化学发光免疫分析系统(简称罗氏E170)和雅培i2000化学发光微粒子免疫分析系统(简称雅培i2000)定量检测慢性乙型肝炎不同感染阶段、不同基因型患者的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)结果的一致性。方法收集临床未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清样本共125例,根据《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中的标准,将样本分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期4组,同时根据基因型(B/C)及HBs Ag水平(HBs Ag≤1 000 IU/m L/HBs Ag1 000 IU/m L)分组。用罗氏E170和雅培i2000 2种系统平行检测HBs Ag,分析各组间2种系统检测结果的一致性。结果 2种系统检测结果总体相关性、一致性好(r=0.989,P均0.001);在4个不同感染阶段,2种系统检测结果的相关性好(r值为0.977~0.993,P均0.001);在一致性分析中,免疫清除期、低复制期和再活动期样本检测结果的一致性较好,但在免疫耐受期罗氏E170检测结果较雅培i2000高,偏差为0.114 log IU/m L;B、C基因型组2种系统检测结果的相关性、一致性均好(r值均0.95,P均0.001);在HBs Ag高水平组中,2种系统检测结果的r值为0.959(P0.001),相关性较HBs Ag低水平组略差,但在专业可接受范围内;且在HBs Ag高水平组中,2种系统的偏差较大,罗氏E170检测结果比雅培i2000平均高0.076 log IU/m L。结论 2种系统检测不同感染阶段及不同基因型样本的相关性和一致性较好,但在检测免疫耐受期及高值样本时罗氏E170结果较雅培i2000偏高。临床上用HBs Ag预测抗病毒治疗的效果时,治疗前后应尽量选择同一系统的结果,以避免由于不同系统间的差异造成对治疗效果的错误评估。