Dickkopf-1时间分辨免疫荧光分析方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的 建立Dickkopf-1(DKK-1)时间分辨免疫荧光分析(TR-IFMA)方法,并评价其在肺癌诊断和病理分期中的价值.方法 用双抗夹心原理建立DKK-1 TR-IFMA,并对其灵敏度、批内、批间差异和准确性等各项指标进行考核.同时用以测定212例肺癌、72例肺良性疾病患者和120名健康人血清DKK-1含量,以分析血清DKK-1水平与肺癌不同临床病理特性的相关性.结果 DKK-1TR-IFMA的稳定性好,线性宽,其检测灵敏度为0.08μg/L,批内和批间变异系数均<6.5%,与商业ELISA试剂盒相关性好(r=0.972,P=0.01).肺癌组血清DKK-1水平[31.93(79.47～18.03)μg/L]显著高于肺良性疾病组[15.25(18.41～11.49)μg/L]和正常对照组[13.90(16.91～11.02)μg/L],但DKK-1水平与年龄、性别、肺癌病理组织类型无关,与TNM分期(r=0.37,P<0.001)、有无淋巴结转移(r=0.52,P<0.001)和远处转移(r=0.62,P=0.001)显著相关;血清DKK-1诊断肺癌的总敏感度为68.4%,特异度为92.2%,准确性为82.1%,阳性预测值为90.6%,阴性预测值为72.5%;血清DKK-1诊断小细胞性肺癌的敏感度和准确性稍高于非小细胞性肺癌(70.7%vs 69.5%,85.6%vs 80.7%).结论 DKK-1可作为一项肺癌血清学标志,适用于肺癌的辅助诊断和病理分期.TR-IFMA检测血清DKK-1方法准确可靠,且为肺癌的DKK-1定量检测提供了技术平台.     

靶向VEGF基因siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用

目的建立特异性靶向VEGF基因表达的siRNA质粒,在肿瘤细胞内诱导RNA干扰,抑制VEGF表达,观察siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用.方法构建针对人VEGF mRNA干扰质粒载体pRNAH-VEGF和对照载体pRNA-Ctr并转染人乳腺癌的MCF-7细胞株.采用RT-PCR和Western blot检测VEGF在mRNA和蛋白水平的表达抑制作用.用放射性核素32P胶体作为放射源照射细胞24 h,采用克隆形成实验分析siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用.结果与对照组相比较,转染了pRNAH(VEGF的MCF-7细胞VEGF mRNA和蛋白质抑制率均明显下调,细胞培养液上清中VEGF浓度下降了60.6%;siRNA和放射性核素联合使用组细胞克隆数量明显少于各自单独使用组;联合使用组细胞凋亡率也高于单独使用组.结论针对人VEGF mRNA干扰质粒载体有效地抑制内源性VEGF表达,增强了放射性核素对肿瘤细胞的杀伤作用.利用RNA干扰技术抑制VEGF表达可作为肿瘤放射治疗中的辅助治疗,以增加疗效.     

胰腺癌转基因小鼠模型研究进展

胰腺癌是人类恶性肿瘤中最为致命的一种,癌基因KRAS的突变,抑癌基因(如CDKN2A、SMAD4)的失活或缺失以及大量信号途径的变化是胰腺癌的重要特征。因此,为弄清胰腺癌的这些生物学行为以及制订合理的治疗方案,建立模拟胰腺癌发生、发展过程的实验动物模型显得尤为重要。目前,基于KRAS突变的转基因小鼠模型较好地模拟了胰腺癌的癌前病变过程,结合其他抑癌基因的缺失或突变,进一步展示了胰腺癌的进展过程,如侵袭和转移等。该文就胰腺癌转基因小鼠模型予以综述。     

人脑胶质瘤组织中RNA分离方法的改良

采用改进的异硫氰酸胍／氯化铯超离心法，从人脑恶性胶质瘤组织中分离总ＲＮＡ，ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ为２．０２。甲醛变性凝胶电泳、溴化淀染色显示，２８ｓ和１８ｓｒＲＮＡ条带清晰，且２８ｓ条带的荧光强度约为１８ｓ条带的２倍。再经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ亲和层析纯化得到ｍＲＮＡ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ转移印迹分析表明，用该方法所分离得到的ｍＲＮＡ无降解，完整性好，核酸纯度完全符合进一步实验研究（如进行反转录合成ｃＤＮＡ等）的要求。     

肝癌细胞中WIF-1的甲基化状态分析

目的探讨WIF-1基因在肝癌细胞中的甲基化状态及其与蛋白表达的关系,并初步研究了WIF-1与肝癌发生发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)和测序方法分析了9种肝癌细胞系中WIF-1启动子区的甲基化状态,用RT-PCR检测了其mRNA的表达。用去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理肝癌细胞株并分析其mRNA和蛋白的表达的变化。结果6种肝癌细胞中检测到异常的甲基化,甲基化率为66.7%。在用5-Aza-CdR处理细胞后,WIF-1表达缺失的肝癌细胞系不同程度地恢复了表达。MTT法分析发现WIF-1对SMMC-7721(7721)细胞生长有较为显著的抑制效果。结论推断WIF-1启动子区频繁甲基化的现象可能是它在肝癌中表达沉默的主要机制,并在肝癌的发生发展起作用。     

酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究

目的　分离和克隆肝癌相关基因。方法　我们用高通量功能筛选和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2 (homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)。结果　LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达 ,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1Hs- 1。放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体 1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用 ;另外 ,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用 ,提示该基因可能参与细胞的生长调控。结论　LASS2是一个新的肝癌相关基因。     

骨桥蛋白参与肿瘤转移相关信号途径的研究进展

骨桥蛋白是一种分泌型磷酸化糖蛋白,是细胞基质蛋白小整合素结合配体N端连结糖蛋白(small integrin-binding ligand,N-linked glycoprotein,SIBLING)家族中的一员,广泛表达于多种组织细胞中.骨桥蛋白与细胞外基质发生相互作用,作为信号分子涉及到多种生物学功能,包括细胞黏附、迁移、免疫反应、炎症反应、骨的钙化以及抗凋亡等.随着研究的深入,发现骨桥蛋白在肿瘤侵袭和转移的多个环节中起着重要作用并涉及多条相关信号途径.本文主要讨论骨桥蛋白在肿瘤转移中相关信号通路的新近研究进展及其在肿瘤转移过程中的作用.     

靶向LASS2基因的小干扰RNA对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向人源性长寿保障基因2(homosapiens longevity assurance homologue 2,LASS 2)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌细胞MHCC97-L体外侵袭能力的影响.方法:通过脂质体转染将靶向LASS2的siRNA转染MHCC97-L细胞,运用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)检测转染后LASS2 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;运用 BCECF氢离子敏感荧光探针检测MHCC97-L细胞跨膜运输氢离子的功能;采用Western印迹法分析MHCC97-L细胞及上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达情况;应用明胶酶谱法检测MHCC97-L细胞上清液中MMP-2的活性; Transwell法检测细胞体外侵袭能力.结果:筛选得到靶向LASS2的有效siRNA-1片段.MHCC97-L细胞转染LASS2 siRNA-1后,其跨膜运输氢离子的能力增强,与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2蛋白的表达及分泌无明显变化,但分泌的MMP-2活性形式增加,与空白对照组和无关序列组比明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且细胞的体外侵袭能力明显高于无关序列组和空白对照组(P<0.05).结论:靶向LASS2的siRNA能有效下调其表达,并能提高MHCC97-L细胞在转染LASS2 siRNA后的体外侵袭能力.     

环孢素A增强三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡

目的:探讨环孢素A(cyclosporine A,CsA)联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对脑胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡的影响.方法:CsA联合ATO作用U87-MG细胞后,应用MTT法检测细胞的存活率及ATO半数抑制浓度(half inhibition concentration, IC50),FCM法检测细胞周期的改变,荧光显微镜下观察及FCM法定量分析经吖啶橙(acridine orange,AO)活体染色后细胞质内酸性自噬泡(acidic vesicular organelles,AVO)的形成情况;Western印迹法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平.结果:小剂量CsA (2 μmol/L)联合ATO可明显抑制U87-MG细胞的生长,CsA可增加ATO诱导的细胞自噬性死亡,使ATO的IC50值由单独作用时的4.28 μmol/L降低至联合作用时的1.28 μmol/L;与对照组相比,CsA联合ATO作用后G2/M期细胞明显减少(P<0.05);AO活体染色可见,CsA联合ATO作用可显著增加细胞内的AVO形成,与CsA、ATO单独作用组相比差异有统计学意义(P<0.01); Western印迹可见CsA联合ATO作用后细胞内Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达明显上调,与对照组和单独作用组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:CsA可以增强ATO诱导的恶性脑胶质瘤细胞U87-MG的自噬性死亡,为恶性脑胶质瘤的治疗提供新的方向.