人穿孔素C端肽段的放射诱导表达

目的 观察克隆的人穿孔素(perforin,PFN)羧基端肽段在肺癌细胞SPC-A1中的放射诱导表达及其对该细胞的杀伤活性.方法 用PCR方法获取hPFN-C基因片段,将该基因片段克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1( )/Egr-1,脂质体介导转染SPC-A1细胞.放射诱导表达后,RT-PCR、免疫细胞化学方法检测该基因片段在SPC-A1中的表达.MTT法检测该基因片段的表达产物对SPC-A1细胞的杀伤活性.结果 成功获取hPFN-C基因片段,构建了放射诱导表达的真核表达载体,转染SPC-A1细胞后,免疫细胞化学法证实目的蛋白出现在细胞质中,而未照射的细胞则没有hPFN-C基因表达. MTT法检测显示,与对照组相比,有hPFN-C 表达的SPC-A1细胞存活率仅为0.657.结论 成功构建hPFN-C基因片段的放射诱导表达载体,它在SPC-A1细胞中获得可控性表达,其表达产物对该细胞具有较强的杀伤活性.     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。     

噬菌体模拟抗原替代亲环素A在测定自身抗体中的应用

目的 探讨噬菌体展示肽库来源的模拟抗原替代重组人亲环素A(rhCyPA)在测定自身免疫病人血清抗亲环素自身抗体中应用价值。方法 以抗人亲环素A单克隆抗体(McAb)D4和E6作捕获抗体对噬菌体展示肽库进行淘筛，通过序列测定推断出模拟抗原氨基酸序列。再以筛出的模拟抗原包被微孔板，与重组人亲环素A抗原进行对比，用ELJSA法检测系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素自身抗体。结果 从12肽库淘筛出的10个噬菌体克隆中9个共有一致氨基酸序列HWEYTISPHPRL。56例SLE患者血清用12肽模拟抗原的ELISA测定，CyPA自身抗体阳性率为50％(28／56)，用rhCyPA作包被抗原测定阳性率为43％(214／56)；两法检测34例其他自身免疫病的阳性率均为11％，两法结果符合率为95．6％。通过试验比较，12肽模拟抗原用于检测CyPA自身抗体优于重组抗原和7肽模拟抗原。结论用抗CyPA单克隆抗体从噬菌体展示肽库淘筛出的特异12肽能模拟亲环素A抗原表位信息，可以代替亲环素A用来检测其自身抗体。     

LDH释放法检测肿瘤患者PBMC和CIK细胞的细胞毒活性

目的建立检测细胞毒活性的乳酸脱氢酶（LDH）测定法，了解肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的抗肿瘤活性，为肿瘤的免疫细胞治疗提供参考。方法采集肿瘤患者和健康成人外周血，常规分离PBMC，体外进行CIK的培养，用LDH释放法分别检测PBMC和CIK对肿瘤细胞K562的细胞毒活性。结果肿瘤患者PBMC对K562的杀伤活力比正常人显著降低（P〈0．05）。经多种细胞因子诱导培养7～10d后，健康人和肿瘤患者的CIK对K562的杀伤活力都有显著提高（P〈0．01），肿瘤患者CIK杀伤活力接近于健康人。结论肿瘤患者PBMC细胞毒活性显著降低，但经诱导培养成CIK后则显著提高。用LDH释放法检测肿瘤病人CIK细胞毒活力，有助于CIK疗法适应病人的选择及个体疗效观察。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

目的建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶Gli T(thioredoxin reductase Gli T,TR)的双抗体夹心ELISA法,并用于几种真菌培养上清液中TR蛋白的检测。方法纯化鼠抗人TR单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。以纯化羊抗TR多克隆抗体为包被抗体,HRP标记鼠抗人TR单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法。用方阵滴定法确定包被抗体和检测抗体的最适浓度;对方法的精密度、特异性和最低检测限进行评价;比较分析其检测3种常见曲霉(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)培养上清中天然TR蛋白的能力,并与3种常见假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌)作比较。结果方阵滴定的结果显示最适包被抗体浓度为1μg/m L,最适检测抗体的稀释度为1∶3 000。抗原最低检测限达2.25ng/m L。重组TR浓度为5 ng/m L和20 ng/m L时,批内和批间变异系数分别为8.57%、12.69%和6.73%、10.45%。阻断实验显示该法有较好的特异性,阻断率达84.7%。该法可以检出烟曲霉24 h培养上清中的天然TR,TR含量与烟曲霉菌丝含量呈正相关。本法与另2种曲霉和3种假丝酵母菌培养上清无交叉反应。结论成功建立并优化了检测烟曲霉TR抗原的ELISA法。该法具有良好的精密度及特异性,对烟曲霉感染有潜在的诊断价值。     

用免疫蛋白质组学技术筛选烟曲霉分泌蛋白中的免疫优势抗原

摘要：目的：用免疫蛋白质组学技术筛选烟曲霉分泌蛋白中的免疫优势抗原,用于侵袭性曲霉病（IA）的诊断标志物及疗效监测。 方法：YEPG培养基培养14 d的真菌分泌蛋白质进行二维电泳（2-DE）分离,用抗曲霉抗体阳性的IA确诊患者混合血清进行免疫印迹,再用质谱分析及生物信息学方法鉴定阳性反应点。 结果：2-DE、免疫印迹结果显示,确诊IA患者血清与分泌蛋白质中多种抗原反应强烈。40个蛋白质点被抗体阳性IA患者血清识别。对40个蛋白质点质谱分析,成功鉴定了39个免疫反应阳性的蛋白质点,代表17种蛋白质,包括分泌型二肽基肽酶V（DppV）、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶、硫氧还蛋白还原酶、醛脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶等。在鉴定出的17种蛋白质中,有2个为已知抗原,15个首次报道为免疫原性蛋白质。有7种免疫原性蛋白质显示有多个蛋白质点。且在新发现的免疫原性蛋白质中,2号蛋白质（共13个蛋白质点）免疫反应最强,鉴定结果为硫氧还蛋白还原酶。 结论：免疫蛋白质组学技术是筛选病原体免疫优势抗原的一种有效方法,此次鉴定的抗原可能是潜在的疾病标志物,但还需进一步地实验加以评估。     

假丝酵母菌属感染评分预测外科ICU患者侵袭性真菌感染

目的采用假丝酵母菌属评分(CS)以预测普通外科ICU患者侵袭性假丝酵母菌病(IC),弥补血培养方法的不足。方法采集2011年6月-2013年5月普通外科ICU 307例患者资料及微生物检验结果,结合临床诊疗实际,参考国外假丝酵母菌属感染评分标准(CS=2×脓毒症+1×外科手术+1×全肠外营养+1×假丝酵母菌属定植),以CS=3作为预测假丝酵母菌属感染的临界值,并将评分结果与真菌培养结果进行比较分析。结果 307例ICU患者中,CS≥3者145例占47.2%;确诊IC感染患者34例,感染率为11.1%;CS≥3的确诊感染IC患者33例,占总体确诊感染IC患者总数的97.1%。结论假丝酵母菌属评分方法早期预测ICU患者侵袭性假丝酵母菌病具有一定的价值,对临床预防性应用抗真菌药物有一定的指导意义。     

精子蛋白17作为妇科肿瘤诊治靶标的实验研究

肿瘤免疫治疗和靶向诊断的关键是寻找合适的肿瘤相关抗原.近年发现,有数十种正常睾丸蛋白在恶性肿瘤中异常高表达[1].目前将这些蛋白归属为一组,统称为癌瘤-睾丸(cancer-testis, CT)抗原.CT抗原具有如下特征[2]:①在男性生殖细胞中高水平表达;②在正常体细胞中很少表达;③在多种类型的肿瘤中异常表达.精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)的基因在一些恶性肿瘤组织中被激活,并高水平表达,是一种新的CT抗原,又称CT22.其在肿瘤诊断和治疗中具有潜在价值,有望作为肿瘤诊断的标志和免疫治疗的靶点,尤其对于女性肿瘤患者.     

精子蛋白17抗体免疫磁性颗粒活性分析及细胞成像研究

目的:制备精子蛋白17(Sp17)抗体免疫磁性纳米颗粒, 以期用于卵巢癌的磁共振成像靶向诊断.方法:在偶联剂EDC/NHS作用下, 将壳聚糖修饰磁性氧化铁纳米颗粒与抗人Sp17抗体结合, 制备抗Sp17抗体免疫磁性纳米颗粒(IMNPs).透射电镜观察颗粒的形貌特征, 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗体与磁性颗粒的结合效果, ELISA检测免疫磁性颗粒的免疫活性.将IMNPs与转染人Sp17的卵巢癌HO-8910细胞共孵育, 进行体外磁共振成像检测.结果:成功实现了抗体与磁性纳米颗粒的偶联, 并且IMNPs保持良好的抗体活性.磁共振显示该颗粒成功靶向Sp17阳性的细胞, 没有发生明显的非特异吸附.结论:该免疫磁性纳米颗粒特异性良好, 可进一步用作卵巢癌的靶向治疗研究.