慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株

目的建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型。方法于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株。Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率。结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率最佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01)。结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础。     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的慢病毒表达载体pFUM3GW。方法NheⅠ和NotⅠ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302;BamHⅠ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物,并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionI将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序。所构建载体命名为pFUM3GW。获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系。结果PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F。结论成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础。     

一种敏感的种及种下分类的分子生物学方法—用于赫坎按蚊种团的种及株的鉴定

我们用改进了的方法,抽提并纯化了按蚊亚属赫坎按蚊种团的中华按蚊A.sinensis的上海地理株,广西株、武汉株和郑州株。雷氏按蚊嗜人亚种A.leeteri anthropophagus的广西地理株和无锡株。凉山按蚊A.liangshannesis,小宽按蚊A.xiaokuanus,克劳按蚊的基因组DNA。结果表明,用这种方法制备的蚊基因组DNA完整,能用于以后的限制酶切等进一步的分子生物学实验。建立了能显示蚊基因组DNA中重复序列DNA的最佳酶切条件,从九种限制     

用染色体缓移法分析 5′端未知序列

随着分子生物学技术的不断发展，基因克隆的方法日新月异。文库筛选获得新序列虽直接可靠，但是工作量大，周期长，耗时耗材耗力，而且选择受限于已有文库，逐渐不作为首选方法采用。 PCR技术自 1985年发明以来，以其快速敏感的特点被广泛应用于基因的表达分析及检测；近年来，其应用范围被进一步拓宽到对未知片段的克隆和分析，其假阳性率高、错配率高等缺陷亦不断得到改进；新的聚合酶的发现，使扩增产物长度可达到 20 kb（ long-distance,LD PCR） [1， 2]。同时，网络资源的共享以及网上生物学软件的免费使用，也使 PCR引物的设计和选择更趋于精确，产物特异性进一步提高。 人鼻咽是位于颅底、咽后壁之间的立方体状结构，本实验室曾用新发展的 cDNA微阵列技术克隆到鼻咽特异性表达基因 YH1[3]。为了实现转基因在鼻咽的定向表达，须获得该基因的特异性调控区。本研究利用染色体缓移的方法， PCR扩增出 YH1基因的 5′端旁侧序列，并初步分析了其调控活性。 1 材料与方法 1． 1 试剂来源 实验中所用的 Human GenomeWalker kit， Advantage-GC Genomic PCR kit， Advantage PCR Cloning kit 等均购自 Clontech公司。 1． 2 染色体缓移 实验流程：分别用 5种限制性内切酶（ DraⅠ ,EcoRⅤ ,PvuⅡ ,ScaⅠ ,SspⅠ）酶切人基因组 DNA，得到五种基因组限制性酶切片段库在基因组限切片段的末端加上接头（内含引物序列）设计两组基因特异性引物，分别与接头中的引物配对，进行巢式 PCR反应凝胶电泳检测，回收特异性 PCR产物后亚克隆测序。     

TGFBR2表达下调可能是鼻咽癌的恶性生物标志

目的该研究拟探索在鼻咽癌发病过程中起着重要作用的关键癌基因或抑癌基因。方法利用基因芯片比较了混合的鼻咽癌细胞株与混合的非癌人鼻咽组织之间的差异表达基因。利用MILANO在线分析程序,寻找已知的癌基因和抑癌基因。免疫组化分析鉴定重要癌基因或抑癌基因表达结果的可靠性。结果MI-NANO分析所有差异表达基因后发现,在鼻咽癌细胞中表达下调比较明显的TGFBR2基因是一个重要的抑癌基因,该基因在TGFβ抑制性信号通路中起着重要的作用,参与了许多肿瘤的发病过程,而且该基因在鼻咽癌的研究中尚未见报道。在免疫组化共检测了56个非癌鼻咽组织和49个鼻咽癌组织后,Mann-Whitney test统计分析发现,与非癌鼻咽组织相比,TGFBR2在鼻咽癌组织中表达明显下调(P<0.001)。结论TGFBR2参与了鼻咽癌发病过程,其表达下调可能促进了鼻咽癌的发生发展,但是否与转移、预后及复发等临床参数相关还有待进一步研究。     

酶联免疫电转移印迹技术(EITB)检测抗EB病毒特异性DNA酶抗体

本研究用酶联免疫电转移印迹技术,检测血清中抗 EB 病毒特异性 DNA 酶抗体,试图建立一种可常规应用于临床的检测方法。结果表明:50例鼻咽癌患者血清中,26例在52～59KD 范围内出现由4条阳性显带融合而成的阳性反应区;健康成人和其他头颈部肿瘤患者血清无一例在此区域内出现阳性显带,表明其特异性甚高。     

肿瘤坏死因子的结构及生物活性

1975年Carswall等在经内毒素处理BCG致敏家兔和小鼠的血浆中发现一种胞毒性因子,这种因子可引起小鼠移植的Math A肉瘤出血性坏死。由于这种因子的胞毒作用只选择性作用于肿瘤细胞,而无损于正常细胞的生物学功能,因此被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。目前对TNF的分子结构、理化性质及生物学活性等已有初步了解,并已建立了TNF编码的基因克隆和进行体外合成TNF。TNF的分子结构及生物学特性的研究证明TNF是一种与干扰素、淋巴毒素、巨噬细胞分泌的细胞毒性因子在生物学特性方面完全不同的另一类细胞毒素。它的功能主要在于:特异性地抑制肿瘤细胞增殖、杀灭肿瘤细胞,它与干扰素有协同抗癌作用,而不影响正常细胞的生长、分化和代谢功能。因此,研究TNF的分     

介绍一种检测蚊虫DNA重复序列的方法

在一般分子生物学方法的基础上,介绍改进了的制备成蚊、幼虫和蛹的基因组DNA,并用限制性核酸内切酶消化基因组DNA,凝胶电泳分离、溴乙锭染色后显示代表重复序列DNA带的一系列方法。本法可直接检测、比较蚊虫DNA重复序列,不受发育阶段、性别的影响,取材方便,简易可行。     

瘤基因的表达与细胞周期

前言随着瘤基因(onc)研究的深入,人们已开始重视其功能和编码产物的作用。不少作者推测onc与细胞生长调节有密切关系。有些onc产物类似某些生长因子受体,如c-sis编码蛋白与PDGF-B链相似,erb-B则编码截缩(truncated)的EGF受体蛋白;