大黄䗪虫丸经p38 MAPK/NF-κB/TGF-β1通路抑制小鼠硅肺纤维化的机制探讨

目的 运用中医经方大黄?虫丸干预小鼠硅肺纤维化模型，观察其对小鼠硅肺纤维化的影响并探讨其作用机制。方法 选用SPF级雄性昆明种小鼠36只，分为正常组，模型组，大黄?虫丸高、中、低剂量（1.560，0.780，0.390 g·kg^-1）组，汉防己甲素组（0.039 mg·kg^-1），每组6只。除正常组外，其余组均用静式染毒法连续40 d吸入二氧化硅（SiO₂）粉尘复制小鼠硅肺纤维化模型，并用相应药物进行干预28 d后处死小鼠，获得血清和肺组织样品，运用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β），IL-6和羟脯氨酸（HYP）的含量，运用肺组织样本进行病理切片观察，并采用蛋白免疫印迹法（Western blot），实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）方法检测肺组织中p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），核转录因子-κB（NF-κB），转化生长因子-β₁（TGF-β₁），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），Smad2，Smad3，Smad7的蛋白和mRNA的表达水平。结果 与正常组比较，模型组中的TNF-α，IL-1β，IL-6和HYP的含量均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，大黄?虫丸高剂量组能够明显降低小鼠血清中TNF-α，IL-6和HYP的含量（P<0.05，P<0.01），可见大黄?虫丸能够减轻硅肺小鼠肺部炎症。同时，与正常组比较，模型组中的p38 MAPK，NF-κB p65，TGF-β₁，α-SMA，Smad2和Smad3蛋白和mRNA表达水平均明显升高（P<0.05，P<0.01），Smad7蛋白和mRNA表达水平均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，大黄?虫丸高剂量组中的p38 MAPK，NF-κB p65，TGF-β₁，α-SMA，Smad2和Smad3蛋白和mRNA表达水平均明显降低（P<0.05，P<0.01），Smad7蛋白和mRNA表达水平均明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论 大黄?虫丸能改善硅肺小鼠肺泡炎症、细胞外基质沉积的情况，因而起到减轻纤维化的作用，这可能是通过调节p38 MAPK/NF-κB/TGF-β₁通路来实现的。     

二甲双胍增强放射对CT26WT细胞及小鼠移植瘤效应机制研究

目的 探讨二甲双胍(Met)联合放射对结肠癌CT26WT细胞及移植瘤的抑制作用及其机制研究。方法 利用CellTiter-Glo化学发光细胞活性试验检测0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L的Met对CT26WT细胞活力影响,克隆形成试验检测对照组、10.0μmol/L的Met、15Gy照射、15Gy+10.0μmol/L的Met组对CT26WT细胞的增殖抑制作用。构建Bablc小鼠皮下移植瘤模型,肿瘤体积>150mm³随机分对照组、单纯15Gy照射、Met组、15Gy+Met组,照射前24h给予小鼠750 mg/kg的Met,定期测量肿瘤体积及小鼠体重绘制肿瘤生长曲线及生存时间曲线。蛋白质印迹法检测上述处理条件下CT26WT细胞及移植瘤组织中P-H2AX、Sting蛋白表达;并利用免疫组化方法检测移植瘤组织中CD8a (+) T细胞的浸润情况。结果 0、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L的Met的相对细胞存活率分别为100%、87.9%、87.8%、87.3%、76.5%(P<0.05),其中10.0μmol/L较5.0μmol/L抑制作用更强(P<0.001)。克隆形成实验结果显示对照组、Met组、15Gy组、15Gy+Met组细胞克隆形成率分别为34.0%、24.0%、22.3%、14.0%(P<0.001)。与对照组比较,Met组、15Gy组、15Gy+Met组细胞内Sting蛋白表达分别增加2.99、1.37、4.41倍(P<0.001、<0.01、<0.001)。15Gy+Met组P-H2AX蛋白表达较15Gy组增加1.43倍(P<0.001)。移植瘤体积15Gy+Met组较对照组生长缓慢,最终结果为(1007.0±388.5)、(2639.0±242.9) mm³,(P<0.05),15Gy+Met组小鼠总生存期较对照组增加(48d︰32d,P<0.001)。移植瘤组织中P-H2AX、Sting蛋白表达量在15Gy+Met组较对照组分别增加8.8、1.6倍(P均<0.001)。15Gy+Met组CD8a (+) T细胞浸润在较对照组明显增高(P<0.01)。结论 Met与放射联合能协同抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成,可能作用机制是通过加重DNA损伤、激活Sting信号通路导致肿瘤组织中CD8a (+) T细胞增加加强对肿瘤细胞的杀伤作用。     

川芎嗪通过激活PKCα/Nrf2信号转导抑制七氟烷诱导的氧化损伤和血脑屏障破坏研究

目的:研究川芎嗪对七氟烷引起的氧化损伤以及血脑屏障(BBB)生理功能损伤的影响及其机制。方法:将新生幼鼠随机分组,设置对照组,并分别使用七氟烷、七氟烷和溶剂、七氟烷和川芎嗪处理小鼠,暴露于七氟烷中不同时长处死并收集小鼠大脑和海马组织,通过免疫酶联吸附检测ROS,SOD,MDA,GSH和S100β蛋白水平,制作小鼠大脑和海马组织切片并通过免疫化学染色和免疫荧光染色检测小鼠大脑和海马组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2以及HO-1的表达,并检测Nrf2的核易位,HE染色后通过透射电子显微镜检查海马神经元损伤情况,通过蛋白质印迹分析PKC/Nrf2以及MMP-2、MMP-9表达情况,使用原位酶谱检测明胶酶活性并通过PCR检测ZO-1的表达。结果:与对照组相比,七氟烷组海马神经元损伤明显,而川芎嗪处理可以明显改善七氟烷诱导的海马神经元损伤; 与对照组相比,七氟烷处理后MMP-2、MMP-9表达和明胶酶活性明显增加,ZO-1表达明显减少,BBB通透性显著增加,而TIMP-1和TIMP-2表达无显著改变; 与七氟烷组相比,川芎嗪可以抑制明胶酶活性,促进ZO-1表达,改善BBB生理状态; 与溶剂组和七氟烷组相比,对照组和川芎嗪组ROS和BMD水平明显降低,MDA和GSH活性显著增加,PKCα、Nrf2和HO-1 的表达以及Nrf2的核易位显著增加。结论:川芎嗪可以通过PKCα/Nrf2信号通路以及抑制明胶酶活性,改善BBB通透性,保护海马免受氧化应激的伤害,改善海马体组织病理学结构。     

调衡方对Lewis肺癌荷瘤体巨噬细胞吞噬功能的影响＊

目的 研究调衡方对Lewis肺癌荷瘤小鼠巨噬细胞形态、 数量及活性的影响，探讨调衡方对荷瘤体巨噬细胞作用的免疫调节机制。方法 将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于小鼠右腋皮下建转移肺癌模型；灌胃给药8 d后，从小鼠腹腔分离抽取巨噬细胞并培养；调衡方各组巨噬细胞培养48 h后，在显微镜下观察活细胞的形态，墨汁吞噬试验以及金葡菌吞噬试验观察巨噬细胞的吞噬能力，细胞酶化学染色观察巨噬细胞胞内酸性磷酸酶的变化，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各培养组M?上清中IL-1、IL-6、TNF-α表达水平。结果 调衡方小、中、大剂量各组巨噬细胞培养48 h后，与对照组比较，巨噬细胞体积显著增大，对墨汁和金葡菌的吞噬能力均显著提升，酸性磷酸酶的活性也明显增强，且能抑制炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α分泌，这均与给药浓度呈正相关。结论 调衡方能增强巨噬细胞的吞噬功能，进而提高胞内酸性磷酸酶等的活性，通过抑制巨噬细胞分泌炎性因子（IL-1、IL-6、TNF-α）有控制巨噬细胞向M2型极化的可能，并减轻肿瘤浸润程度，降低肿瘤发展及转移，而发挥抗肿瘤免疫调节的作用。     

健脾益气法对结直肠炎病变后诱发结直肠癌小鼠的影响研究

目的:观察健脾益气中药对结直肠炎病变后诱发结直肠癌小鼠白细胞介素(Interleukin,IL)-6和表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)蛋白的影响。方法:将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组,每组10只。采用偶氮氧化甲烷/葡聚糖硫酸钠方法建立结直肠炎相关结直肠癌小鼠模型,治疗组以加减四君子汤颗粒加蒸馏水配成溶液,药物质量浓度19.92%,3.32 g/kg灌胃,模型组以蒸馏水灌胃。4周后处死各组小鼠并留取血液和结直肠组织组织标本,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent method,ELISA)法检测血清IL-6浓度,苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin Staining,简称HE染色法)染色镜下观察小鼠结肠组织病理变化,Western-blot法检测EGF蛋白表达。结果:健脾益气治疗组小鼠的体质量较模型组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组小鼠血清IL-6表达量比模型组显著下降,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组小鼠的EGF蛋白表达显著降低,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:健脾益气中药能增加结直肠炎病变后诱发结直肠癌小鼠的体质量,减少炎症因子IL-6的表达和降低EGF蛋白表达,可为健脾益气中药抗结肠癌临床应用提供科学依据。     

从免疫炎性损伤角度探讨5种清热解毒药物抗流感的机制及其临床意义

目的探讨黄芩、板蓝根、白头翁、虎杖、白花蛇舌草5种清热解毒代表药物抗流感病毒感染所致免疫炎性损伤的作用机制。方法在流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株FM1感染小鼠后的不同时相(初期、极期、后期),采用ELISA法,动态观察清热解毒代表药物对小鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)5种炎性细胞因子含量的影响。结果黄芩在感染后第3日可显著降低血清TNF-α、IL-1、IL-6含量,并于感染后各时相均可增加IFN-γ含量,感染后第1~5日增加IL-10含量。板蓝根在感染后第3日能显著降低血清TNF-α含量,第3~5日降低IL-6含量,并在感染后第1天升高IL-10含量,在感染后第3~5日能升高IFN-γ含量。白头翁在感染后第3日能明显降低血清TNF-α、IL-1、IL-6含量,同时显著升高IL-10含量。虎杖在感染后第1日可显著升高血清IL-10含量,在感染后第5日升高IFN-γ含量。白花蛇舌草在感染后第3日降低血清IL-6含量,在感染后第5日升高IFN-γ含量。结论黄芩的抗流感作用主要表现在流感病毒感染引起的急性外感热病的极期;板蓝根在流感病毒感染的各个时相均有一定的治疗作用;白头翁在流感病毒感染的极期可抑制炎性损伤;虎杖在感染流感病毒的初期与后期均可减少促炎性细胞因子的分泌;白花蛇舌草在流感病毒感染的极期及后期均可起到一定的抗免疫炎性损伤。各药物均具有抑制炎性损伤、防止多脏器功能衰竭、防止休克、退热和抑制促炎性细胞因子的分泌,调节机体免疫,从而减轻炎症反应的作用。     

小鼠股骨缺损模型的构建及SDF-1表达的检测

目的寻找更优的小鼠骨缺损模型的制作方法,同时动态监测SDF-1在骨缺损部位的表达。为研究SDF-1在骨缺损修复中的作用奠定基础。方法使用打磨机,于小鼠股骨中段制造范围约2 mm×2 mm骨缺损,免疫组化法动态检测小鼠骨缺损部位SDF-1表达情况。结果动物生存情况,除一只在术中死亡外,其余动物均术后存活,进食活动正常,未出现伤口感染情况。骨缺损模型建立后,骨缺损侧SDF-1表达较健侧明显持续增高。骨缺损侧和未手术侧SDF-1表达水平,差异有统计学意义(P <0.05)。结论使用打磨机打磨方法制造骨缺损,过程快速,大小范围较传统骨钳安全有效,可重复性好,动物模型一致性好,可控制性强,为下一步组织工程骨植入提供了较好的动物模型。骨缺损发生后,局部SDF-1分泌增加。在骨缺损修复过程中,SDF-1呈现持续的高表达,说明SDF-1在骨缺损修复过程中的干细胞趋化作用中可能发挥重要作用。     

慈菇多糖对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

目的观察慈菇多糖干预S180肿瘤模型的小鼠实验,研究其抗肿瘤的功效。方法将ICR雄性小鼠48只按体重随机分为6组:模型组、慈菇多糖低、中、慈菇多糖高剂量组(100、200、300 mg/kg·d)、香菇多糖组(0.577 mg/kg,2次/周)和环磷酰胺组(20 mg/kg·d)。前11 d慈菇多糖组按各自剂量灌胃,其余组以等量蒸馏水灌胃,第11 d建立S180荷瘤小鼠动物模型。造模次日开始,各剂量组小鼠给予相应药物,连续11 d。第23 d测定小鼠抑瘤率、瘤重、脏器指数、血清细胞因子、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)。结果与模型组比较,环磷酰胺组的抑瘤率最高(72.4%),慈菇多糖高剂量组次之(68.4%),两组瘤重均降低;慈菇多糖中、高剂量组和香菇多糖组的脾脏指数升高;慈菇多糖各剂量组的TNF-α、IL-2水平均有所提高;慈菇多糖各剂量组、香菇多糖组MDA值下降,慈菇多糖高剂量组、香菇多糖组SOD值升高。结论慈菇多糖可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,可能与提升小鼠免疫功能和增强抗氧化作用有关。