miRNA⁃205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用

目的：构建miRNA?205过表达载体并研究miRNA?205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法：对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA?205前体序列,并将其克隆于基础表达载体pCAGDNA3?hFat1,构建过表达载体pCAG?miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞（含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc）。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA?205的表达情况,比较分析miRNA?205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果：成功构建了pCAG?miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA?205表达量显著升高（P＜0.01）;利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论：研究结果表明在细胞水平上过表达microRNA?205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA?205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA?205的细胞系,为进一步深入研究miRNA?205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。     

异种心脏瓣膜的研究进展

随着器官移植技术的不断进步,越来越多的患者通过器官移植治愈疾病、延长寿命。虽然如今器官移植技术已经非常成熟,但是器官供体短缺仍是亟需解决的问题,许多患者因无法获得合适的移植器官而死亡。     

用于异种移植的新型基因改造猪的培育

目的培育用于异种移植的新型基因改造猪,在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白（TM）基因转入的基础上,进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向（CⅡTA-DN）基因转入猪胎儿成纤维细胞,以抑制猪白细胞抗原（SLA）Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素（Zeocin）抗性基因片段,并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMVB—actin启动子下游的pNMU105／CⅡTA-DN表达载体,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B（DKO／CD46／TM）。Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181B细胞中的转入,获得阳性单克隆并进行核移植,得到DKO／CD46／TM／CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105／CⅡTA-DN表达载体,经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定,在592bp位置检测到预期条带,证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育,在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4＋T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建,为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。     

猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备

目的：从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法：利用生物信息学方法分析人、猪、鼠 SALL1 的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪 Sall1 基因第 1 外显子区域设计单链引导 RNA(single guide RNA, sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证 PX330?sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论：生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。     

稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立

目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系?方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中?利用碱性磷酸酶染色?RT-PCR?免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性?结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性?核转染前后hESCs的Oct4?Sox2?Klf4?Nanog基因的表达未出现明显差异?RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上?结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究?     

n⁃3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用

目的：探讨n?3多不饱和脂肪酸（n?3 poly unsaturated fatty acid,n?3 PUFA）对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。 方法： 野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾 细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4+ T细胞,将其分 为4组：野生型 鼠为Wild type组;NOD小鼠分为未处理组、二十二碳六烯 （docosahexaenoic acid,DHA）处理组、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）处理组。DHA、EPA处理24h,PMA和Ionomycin刺激活化后,采用CCK?8法检测T细胞增殖 流式细胞仪检测Th1/Th2极化、ELISA法检测T细胞细胞因子的分 水平变化。结果：DHA、EPA对T细胞增殖具有显著抑制作用,促 NOD小鼠Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,经ELISA检测,DHA EP 能够抑制T细胞IL?6、IL?17的分泌。结论：n?3多不 饱和脂肪酸 过抑制T细胞增殖,平衡Th1/Th2比例和抑制IL?6、IL?17的分泌对NOD小鼠的T淋巴细胞起到免疫抑制作用。     

成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定

目的：探讨成年小鼠大脑室下区神经干细胞（neural stem cells, NSCs)体外分离培养和鉴定的方法,测定体外培养的神经干细胞多不饱和脂肪酸n6/n3的比例和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）含量。方法：取8~10周龄的C57BL/6小鼠室下区细胞,进行体外悬浮培养,观察NSCs形成情况,免疫荧光鉴定NSCs干细胞特性及体外分化能力,气相色谱鉴定NSCs的多不饱和脂肪酸含量中n6/n3比例及DHA含量。结果：体外培养的细胞可以增殖,并可以连续传代;免疫荧光显示神经干细胞呈抗巢蛋白阳性,神经干细胞在分化培养基培养时可分化为NeuN、TuJ1、GFAP、O4阳性细胞;神经干细胞的多不饱和脂肪酸含量较鼠尾高。结论：采用无血清培养基成功获得成年小鼠室下区的神经干细胞,具有增殖、自我更新和分化的能力;神经干细胞的n3多不饱和脂肪酸含量明显高于鼠尾中的含量,且DHA多不饱和脂肪酸占较高比例。     

整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子（OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5）的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的相关研究奠定基础。方法：以PEF细胞cDNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段（RLD）,最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体pTRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果：扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1（975bp）、LIN28（727bp）和DPPA5（408bp）,并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体（pTRE3G-Zs-OCT4、pTRE3G-Zs-TBX3、pTRE3G-Zs-RLD）,且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与pEF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论：成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?     

利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系

目的：利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维（porcine fetal fibroblast,PFF）细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法：首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具（http：//www.e?crisp.org/E?CRISP/designcrispr.html）设计并合成单链向导 RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论：人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。