用于异种移植的新型基因改造猪的培育

目的培育用于异种移植的新型基因改造猪,在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白（TM）基因转入的基础上,进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向（CⅡTA-DN）基因转入猪胎儿成纤维细胞,以抑制猪白细胞抗原（SLA）Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素（Zeocin）抗性基因片段,并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMVB—actin启动子下游的pNMU105／CⅡTA-DN表达载体,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B（DKO／CD46／TM）。Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181B细胞中的转入,获得阳性单克隆并进行核移植,得到DKO／CD46／TM／CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105／CⅡTA-DN表达载体,经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定,在592bp位置检测到预期条带,证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育,在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4＋T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建,为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。     

n⁃3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用

目的：探讨n?3多不饱和脂肪酸（n?3 poly unsaturated fatty acid,n?3 PUFA）对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。 方法： 野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾 细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4+ T细胞,将其分 为4组：野生型 鼠为Wild type组;NOD小鼠分为未处理组、二十二碳六烯 （docosahexaenoic acid,DHA）处理组、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）处理组。DHA、EPA处理24h,PMA和Ionomycin刺激活化后,采用CCK?8法检测T细胞增殖 流式细胞仪检测Th1/Th2极化、ELISA法检测T细胞细胞因子的分 水平变化。结果：DHA、EPA对T细胞增殖具有显著抑制作用,促 NOD小鼠Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,经ELISA检测,DHA EP 能够抑制T细胞IL?6、IL?17的分泌。结论：n?3多不 饱和脂肪酸 过抑制T细胞增殖,平衡Th1/Th2比例和抑制IL?6、IL?17的分泌对NOD小鼠的T淋巴细胞起到免疫抑制作用。     

GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

目的：利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法：设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表达。结果：成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆 9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其 PBMC无αGal和Sd（a）抗原的表达。结论：CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。     

稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立

目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系?方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中?利用碱性磷酸酶染色?RT-PCR?免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性?结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性?核转染前后hESCs的Oct4?Sox2?Klf4?Nanog基因的表达未出现明显差异?RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上?结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究?     

整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子（OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5）的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的相关研究奠定基础。方法：以PEF细胞cDNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段（RLD）,最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体pTRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果：扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1（975bp）、LIN28（727bp）和DPPA5（408bp）,并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体（pTRE3G-Zs-OCT4、pTRE3G-Zs-TBX3、pTRE3G-Zs-RLD）,且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与pEF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论：成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。     

成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定

目的：探讨成年小鼠大脑室下区神经干细胞（neural stem cells, NSCs)体外分离培养和鉴定的方法,测定体外培养的神经干细胞多不饱和脂肪酸n6/n3的比例和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）含量。方法：取8~10周龄的C57BL/6小鼠室下区细胞,进行体外悬浮培养,观察NSCs形成情况,免疫荧光鉴定NSCs干细胞特性及体外分化能力,气相色谱鉴定NSCs的多不饱和脂肪酸含量中n6/n3比例及DHA含量。结果：体外培养的细胞可以增殖,并可以连续传代;免疫荧光显示神经干细胞呈抗巢蛋白阳性,神经干细胞在分化培养基培养时可分化为NeuN、TuJ1、GFAP、O4阳性细胞;神经干细胞的多不饱和脂肪酸含量较鼠尾高。结论：采用无血清培养基成功获得成年小鼠室下区的神经干细胞,具有增殖、自我更新和分化的能力;神经干细胞的n3多不饱和脂肪酸含量明显高于鼠尾中的含量,且DHA多不饱和脂肪酸占较高比例。     

猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备

目的：从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法：利用生物信息学方法分析人、猪、鼠 SALL1 的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪 Sall1 基因第 1 外显子区域设计单链引导 RNA(single guide RNA, sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证 PX330?sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论：生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。     

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein?coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）基因敲除的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）,为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法：采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果：生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论：人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。     

猪naive⁃like胚胎干细胞向神经细胞体外诱导分化

目的：明确不同时期胎猪的肾脏发育情况,并研究胎猪肾脏发育相关信号分子的表达。方法：收集不同时期（妊娠21.5、27.5、35.0、45.0、75.0及110.0 d）胎猪肾脏组织,应用HE法观察不同时期胎猪肾脏的组织结构。通过实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾脏发育相关信号分子（Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4）的mRNA和蛋白表达水平,并通过免疫组织化学检测Pax2在不同时期胎猪肾脏的表达定位情况。结果：27.5 d胎猪的后肾已经开始发育;35 d早期肾小体已经出现,肾小管也开始发育;45 d观察到近皮质不成熟的肾小体和近髓质成熟的肾小体;75 d肾单位数目显著增加,观察到肾椎体、肾乳头和肾盂;110 d肾脏基本发育成熟,皮髓质分界明显,仍有新的肾单位产生。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4在胎猪75 d的肾脏中mRNA和蛋白表达量高于35 d。Pax2广泛表达于输尿管芽、后肾间充质、帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、S形体以及肾小管,并在后肾发育过程中持续表达。结论：27.5 d时胎猪后肾已经开始发育,110 d基本发育成熟。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4等信号分子在胎猪肾脏发育过程中均有不同程度表达,其中Pax2可能是胎猪肾脏发育的关键调控分子。     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?