狨猴B2m基因沉默位点在细胞水平的验证

目的在细胞水平筛选狨猴B2m基因的有效沉默靶点,并进行验证。方法查询人源B2m验证过的有效siRNA靶位点序列,与狨猴B2m基因序列进行同源性比较,选择匹配靶点合成shRNA序列。将体外合成的2条干扰序列分别与慢病毒载体FUGW-TDT连接,构建FUGW-TDT-shb2m干扰表达质粒,在聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导下转染293T细胞,转染后48h,用实时荧光定量法检测转染细胞中B2m基因mRNA的水平。结果筛选出2个与狨猴完全同源的B2m沉默靶位点,分别位于B2m mRNA的290~310 bp,665~685 bp;B2m两个靶点在转录水平的沉默效率分别为(46.54±7.91)%(P0.05)和(83.22±4.37)%(P0.0001),差异有显著性。结论成功构建成FUGW-TDT-shb2m重组质粒;在细胞水平筛选得到2个有效的B2m基因沉默靶点;为后续有关介导狨猴B2m基因沉默的研究奠定了基础。     

沉默SIAH2基因抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长实验研究

目的 本研究前期实验发现,靶向SIAH2的shRNA载体能显著抑制HepG2细胞SIAH2 mRNA和蛋白的表达,并抑制细胞体外增殖.本研究从体内水平验证靶向SIAH2的干扰载体对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 转染pGenesil-SIAH2的HepG2细胞作为实验组,命名为HepG2-SIAH2;转染空载体pGenesil-1的HepG2细胞作为阴性对照组,命名为HepG2-neo;未转染任何质粒的HepG2细胞作为空白对照组,通过G418筛选出稳定转染细胞株.将15只裸鼠随机分为3组,接种肿瘤细胞后观察裸鼠成瘤情况.4周后测量肿瘤的体积和瘤体质量,绘制移植瘤生长曲线,并用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测移植瘤中SIAH2的表达情况.结果 稳定转染pGenesil-SIAH2的细胞株构建成功,3组裸鼠接种癌细胞后均有肿瘤形成.与空白对照组和阴性对照组相比,实验组肿瘤生长速度明显减慢,实验组平均瘤体积(261.57±41.141)mm3,明显低于阴性对照组(494.35±93.236) mm3(P=0.015)和空白对照组(418.3±28.576 5)mm3(P=0.012),差异有统计学意义;实验组平均瘤体质量为(0.162±0.02)g,明显低于阴性对照组(0.358±0.12)g(P=0.032)和空白对照组(0.322±0.24)g(P=0.028).实验组瘤体内SIAH2 mRNA相对表达量为0.83±0.35,明显低于阴性对照组2.35±0.96(P=0.003)和空白对照组2.57±0.41(P=0.006),差异有统计学意义.实验组瘤体内SIAH2蛋白表达量为0.72±0.02,明显低于阴性对照组2.61±0.67(P=0.004)和空白对照组2.49±0.91(P=0.007),差异有统计学意义.结论 靶向SIAH2的shRNA干扰载体能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,SIAH2有可能成为肝癌基因治疗新的分子靶.     

shRNA结合131I-免疫脂质体抑制胶质瘤细胞U251增殖的初步研究

目的 探索RNA干扰与131I-免疫脂质体联用在胶质瘤疾病治疗中的潜在价值.方法 在合成pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA表达载体的基础上,结合核素内放射性131I免疫脂质体,进行细胞实验探索其对胶质瘤细胞U251增殖凋亡的影响.结果 成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA载体;同时细胞实验结果显示,shRNA和131I免疫脂质体联用有效抑制胶质瘤细胞U251增殖和促进其凋亡,抑制率达70％.结论 shRNA结合131I免疫脂质体能高效地促凋亡和抑制细胞增殖,为其在胶质瘤治疗中的应用奠定了初步基础.     

Livin通过Akt信号途径促进胃癌SGC7901细胞的上皮细胞间质转换

目的探讨胃癌SGC7901细胞中Livin基因的表达对细胞上皮细胞间质转换(EMT)的影响。方法用Livin基因的shRNA慢病毒感染胃癌SGC7901细胞,筛选稳定沉默的细胞株,Transwell检测细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测E-cadherin和vimentin表达,同时检测Akt信号通路的激活状态。结果沉默Livin基因后,胃癌SGC7901细胞侵袭迁移能力明显降低(P0.05),E-cadherin明显上调,vimentin则明显下调(P0.05),同时明显抑制Akt信号通路信号的激活(P0.05)。结论 Livin能够通过激活Akt信号通路从而诱导SGC7901细胞发生EMT,从而促进肿瘤细胞体外侵袭及迁移能力。     

长链非编码 RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定

目的:制备shRNA干扰人长链非编码RNA Linc00461的慢病毒载体（shRNA- Linc00461）,为深入研究长链非编码RNA功能奠定基础。方法：利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计,根据小干扰RNA的设计原则,选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送由公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1,形成pSIH1-H1-shRNA- Linc00461质粒。用PCR及测序对其进行鉴定,之后与慢病毒包装质粒混匀,由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装,产生慢病毒shRNA- Linc00461,并收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231,MTT和流式细胞术检测细胞增殖和周期改变。结果： SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经PCR验证和测序后,证实其构建成功。shRNA- Linc00461在HEK293T细胞中重组成慢病毒,并成功感染MDA-MB-231,感染效率约为70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后Linc00461的表达下调65.32%; 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 结果显示：实验组吸光度值（0.232±0.032）明显低于实验对照组（0.398±0.037）。流式结果提示实验组G2M 期细胞（47.55±5.063）％高于实验对照组（8.876±3.565）％。结论：成功构建了shRNA- Linc00461慢病毒载体,并能有效抑制Linc00461表达,为深入研究人Linc00461基因功能奠定了基础。     

抑制MDR1基因表达shRNA RNAi系统的构建

目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的短发夹RNA(sh RNA)真核表达载体系统.方法根据MDR1基因已知序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列,合成两对62nt 并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamH I和Xba I双酶切后线性 PG E-1载体的U6启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒.结果对重新构建的pshRNA-MDR1载体经P CR扩增后行电泳分析,并对含有插入基因片段行测序分析.结果表明,62个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全一致.结论载体的成功构建为研究其对MDR1 基因表达的抑制作用打下基础,同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法.     

SRC抑制胶质母细胞瘤的增殖、迁移、侵袭和干性维持的分子机制

目的 研究SRC在胶质母细胞瘤发生发展中的作用,并初步探讨可能的分子机制。方法  采用生物信息学的方法分析SRC在胶质母细胞瘤中的表达变化;利用shRNA下调胶质瘤母细胞系U87MG中SRC的表达,通过RT-PCR和免疫印迹法验证其抑制效率,并筛选出稳定干涉的细胞株;采用WST-1法、划痕愈合实验和Transwell迁移实验检测SRC shRNA干涉后细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化;利用干细胞培养液筛选出SRC shRNA稳定干涉的胶质瘤干细胞,观察SRC shRNA对肿瘤干细胞干性的影响;利用细胞免疫荧光法观察干性基因SOX2的表达变化。结果 在胶质母细胞瘤标本中SRC的表达水平高于对照组,筛选到两条有效的SRC shRNA序列;通过shRNA下调SRC的表达后可以显著抑制胶质瘤母细胞U87MG的增殖、迁移、侵袭和肿瘤干细胞干性维持,并且可以明显抑制SOX2的表达。结论 SRC通过调控胶质母细胞瘤的增殖、迁移、侵袭和干性维持影响其发生发展,其对干性维持的作用可能是通过影响SOX2的表达实现的。