(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原在大肠杆菌中的高效表达

为了提高胰岛素原的表达量，用pQE-40质粒构建了(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原[(His)6-Arg-Arg- human Proinsulin，RRhPI]的大肠杆菌表达系统。通过培养条件的优化，在摇瓶培养的条件下，目标产物：RRhPI以包涵体形式获得了高效表达，每升培养基收获湿菌体约27g，包涵体6g(干重1．8g)，RRhPI约540mg。该水平已超过现有文献报道的摇瓶培养的最高水平。     

三种细菌生物被膜中超广谱β-内酰胺酶的检测

目的检测肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌三种细菌的生物被膜(biofilm,BF)中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)的产生。方法用改良平板培养法在硅胶膜上建立肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌BF的体外模型。用银染法及扫描电镜对BF进行鉴定。用双纸片试验检测ESBLs,等电聚焦电泳测定β-内酰胺酶的等电点。结果三种细菌的各30株中,BF肺炎克雷伯氏菌组(A2组)中ESBLs的产生率最高(14株,46.7%),其浮游菌组(A1组)检出8株(26.7%);BF大肠埃希氏菌组(B2组)有10株(33.3%)产生ESBLs,其浮游菌组(B1组)检出6株(20.0%);BF铜绿假单胞菌组(C2组)有3株(10%)产ESBLs,其浮游组(C1组)为2株(6.7%)。浮游菌组中ESBLs的产生率低于BF菌组,其中肺炎克雷伯氏菌及大肠埃希氏菌的BF组和浮游菌组的检出率之间有显著差异(P<0.05)。A2组共检出14株产生ESBLs,有4种ESBLs,等电点分别为8.2(4株)、7.6(8株)、6.3(1株)和5.6(1株),A1组检出8株产生ESBLs,为3种ESBLs,等电点分别为8.2(2株)、7.6(5株)和5.6(1株);B2、B1组检出2种相同等电点分别为7.6(B1组4株,B2组6株)、8.2(B1组2株,B2组4株)的ESBLs;C1、C2组检出一种等电点为6.4的ESBLs(C1组2株,C2组3株)。以pI为7.6的β-内酰胺酶的检出率最高,其     

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-天冬酰胺酶及药代动力学研究

目的建立大鼠血浆中重组E.coli L-天冬酰胺酶的抗体夹心酶联免疫吸附测定法,并进行药代动力学研究。方法应用重组E.coli L-天冬酰胺酶免疫家兔,分离IgG,用DEAE-纤维素柱色谱纯化,辣根过氧化物酶标记抗体,建立抗体夹心酶联免疫吸附法,测定大鼠血浆中重组E.coli L-天冬酰胺酶浓度。结果方法的线性范围为1～64 U·L^-1,血药浓度与时间的关系符合二房室模型,初期和末端的T_1/2分别为0.50～0.57 h和2.45～3.02 h,AUC与剂量成正比。结论建立的抗体夹心酶联免疫吸附法在灵敏度、特异性、线性范围、精密度和回收率等方面,满足药代动力学研究要求。实验方法和重组E.coli L-天冬酰胺酶在大鼠中的药代动力学参数为临床研究提供了手段和依据。     

TRAIL基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的:获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体.方法:利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPreTMH-Tb中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌DH-5α中获得表达,并将TRAIL蛋白免疫家兔,通过Dot blot及Western blot检测抗TRAIL抗体的产生.结果:成功构建TRAIL基因原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11.8%,Dot blot及Western blot检测证实获得了抗TRAIL抗体.结论:成功制备抗TRAIL抗体,这为TRAIL在真核细胞水平研究奠定了实验基础.     

Escherichia coli-induced alterations of human spermatozoa. An electron microscopy analysis

This study evaluated if the negative influence of Escherichia coli on the motility of human spermatozoa is a consequence of E. coli-induced ultrastructural alterations. Suspensions of spermatozoa were artificially infected with E. coli from a serotyped, pathogenic strain and incubated at 37 degrees C for 6 h. After incubation, spermatozoa were fixed in glutaraldehyde, stained with osmium tetroxide and ruthenium red and embedded in Spurr(R)-resin followed by ultramicrotomy. The sections were analysed subsequently by use of transmission electron microscopy. Uninfected suspensions of spermatozoa in medium and bacterial suspensions served as controls. Negative contrast technique was performed to facilitate visualization of ultrastructural details of the bacterial capsule after experimental exposure to spermatozoa. Electron microscopic evaluation revealed multiple and profound alterations in the ultrastructure of spermatozoa such as membrane defects and cytoplasmic vacuoles exclusively in spermatozoa of infected samples (> 90%). Morphological alterations involved all superficial structures of spermatozoa, in particular the plasma membrane of the mid-piece and neck as well as the inner and outer acrosomal membrane of the acrosome, indicating that morphological defects account for the immobilization of spermatozoa by E. coli. The results suggest that E. coli infection of ejaculates results in immobilization and impaired acrosomal function in human spermatozoa, findings that support the indication for antimicrobial chemotherapy in symptomatic and silent infections that affect the ejaculate.     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-门冬酰胺酶研究

用重组E.coliL-门冬酰胺酶免疫家兔，DEAE-纤维素柱层析纯化IgG，采用二步戊二醛交联法将辣根过氧化物酶标记抗体，建立抗体夹心酶联免疫吸附法，测定大鼠血浆中重组E.coliL-门冬酰胺酶浓度。本测定方法的线性范围为1～64U/L，灵敏度为0.4U/L。建立的抗体夹心酶联免疫吸附法测定大鼠血浆中重组E.coliL-门冬酰胺酶具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性。     

羧甲基壳聚糖银、锌、铈的合成及抑菌实验的研究

报道了羧甲基壳聚糖银、锌、铈的合成及其混合物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和变形杆菌的抑菌作用 ,并与磺胺嘧啶银进行比较 ,结果发现 ,羧甲基壳聚糖银、锌、铈水溶液 (含量为 0 .6 95mg/ml,Ag、Zn、Ce含量分别为 0 .2 5 2× 10 6、5 .2 8× 10 6、2 .15 4× 10 6)对上述 5种细菌 (含量为10 4CFU/ml)杀菌率为 96 %以上 ,与 1.0mg/ml磺胺嘧啶银作用相当     

突变型人白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达

目的：建立突变型人白细胞介素-2（rhIL-2）基因大肠杆菌表达系统，为rhlL-2的生产及临床应用奠定基础。方法：自人胎盘组织中提取总RNA，逆转录PCR（RT-PCR）扩增突变型人IL-2基因cDNA，通过对下游引物的设计将编码125位半胱氨酸（c125）的密码子TGT更改为编码丝氨酸的密码子TCT。构建表达型重组质粒pBV-IL-2，温度诱导表达．表达产物行SDS一聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）及WesternBlot鉴定。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放读码框架。SDS-PAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为16．5ku的外源蛋白产生。经Western印迹（WesternBlot）证明为rhlL-2。结论：成功构建了突变型人白细胞介素-2大肠杆菌表达系统。表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中。     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。