胡椒属药材核糖体DNA的ITS序列分析及其分子鉴定

目的：研究核糖体DNA（rDNA）的ITS序列在胡椒属大叶蒟及其近缘药用植物及药材鉴定中的适用性。方法：聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增ITS序列测序,用DNAssist version2.2软件进行序列比对,并计算同源性。结果：胡椒属药材ITS序列与外类群ITS序列比对同源性均小于67.0%,属内序列间两两比对同源性均大于82.0%,同种植物则大于99.0%。结论：ITS序列作为胡椒属药材鉴定依据具有一定的适用性和可靠性。     

蛇床及其近缘物种的ITS2分子鉴定

目的：对传统中药蛇床子基原植物及其近缘物种的ITS2条形码序列进行分析,探讨药用植物蛇床子的分子鉴定方法。方法：采用PCR技术扩增蛇床ITS2基因片段,进行双向测序,运用CodonCodeAligner拼接后,用MEGA5．0软件进行相关数据分析,构建NJ树。应用Schuhz等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果：蛇床与其近缘物种ITS2序列间存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将蛇床及其近缘物种区分开。结论：ITS2可有效地鉴别蛇床及其近缘物种。     

基于ITS2条形码SNPs的人参和西洋参PCR-SSCP分子鉴别研究

目的:依据人参和西洋参ITS2条形码的专属性SNP鉴别位点,建立利用PCR-SSCP技术鉴别人参和西洋参的方法.方法:查找GenBank上已收录的人参和西洋参ITS2序列,进行比对分析,筛选人参和西洋参ITS2序列的专属性SNP鉴别位点,据此设计引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对11个人参样品和10个西洋参样品进行分析,对PCR产物进行测序验证.结果:人参和西洋参样品的PCR-SSCP谱带与各自的对照药材谱带一致,人参和西洋参的PCR-SSCP谱带有显著差异;PCR-SSCP鉴别结果和经测序鉴别结果一致.结论:和测序法相比,PCR-SSCP方法快速、准确,可用于人参和西洋参药材的鉴定.     

三裂叶海棠内生真菌的分离,鉴定及活性测定

目的:分离鉴定三裂叶海棠Malus sieboldii中内生真菌,并检验其抗病原真菌,抗肿瘤,抑制蛋白酶活性。方法:传统形态学和现代分子生物学方法鉴定菌种,采用杯碟法,MTT法,和BRpNA法测试真菌活性。结果:内生真菌按形态学归为22类,其中Non-sporulating,Alternaria,Colletotrichum,Aspergillus,Fusarium,Gliocladium,Cunninghamella是主要群落。通过对ITS rDNA测序,确定了有活性Non-sporulating的种属。活性测试结果显示30的菌株对至少1种植物病原菌有活性,菌株3,4分别具有细胞毒和蛋白酶抑制活性。结论:首次对三裂叶海棠的内生真菌进行了系统的分离、鉴定和活性筛选工作,证明三裂叶海棠是一种寄生活性内生真菌的潜在资源。     

真菌诱导白木香产生沉香的野外实验与分析

 目的 采用野外小规模实验和室内分析相结合的方法验证3株真菌YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导白木香产生沉香的可行性。方法 采用真菌诱导法诱导白木香产生沉香,利用气相-质谱联用技术（GC-MS）对诱导结香材料挥发油成分中的化合物进行检测,通过比对诱导材料高频菌与原接入菌的形态及核糖体基因内部转录间隔区序列（internal transcribed spacer,ITS）一致性来验证接入菌的有效性。结果 3株真菌定植于白木香6个月,YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导产生材料的重量分别为（1.786±0.473）,（2.964±0.492）和（3.615±0.591） g,高于空白对照（1.325±0.407） g和阴性对照（1.462±0.417） g。GC-MS检测到3株活性真菌诱导材料含有代表沉香品质的主要化学成分倍半萜类化合物和色原酮类似物。菌种验证结果表明,3株活性真菌在诱导材料中为优势菌,分别占分离菌种的90.0%,97.5%和91.25%。结论 利用3株活性真菌诱导白木香产生沉香可以应用于实际生产,是可持续、高效生产沉香的良好方法。     

基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定

山豆根是我国常用中药材,对山豆根基原植物及其易混伪品进行DNA分子鉴定研究具有重要意义。本文对5科9属38个物种84份山豆根基原植物及其混伪品样品的ITS2序列进行序列变异分析、K-2p遗传距离比较及NJ系统发育聚类树构建。结果表明所研究山豆根基原植物样品种内ITS2序列无变异,与其同属密切相关物种的ITS2序列变异位点为102个,平均K-2p遗传距离为0.072,与其他混伪品的ITS2序列变异位点为200个,平均K-2p遗传距离为0.594。山豆根基原植物在NJ系统发育聚类树上聚为一支,支持率为98。因此,ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区分山豆根基原植物及其混伪品,为山豆根药材及其混伪品的鉴定提供基础。     

Identification of yeast isolated from dermatological patients by MALDI-TOF mass spectrometry

Species identification of yeasts is based on biochemical (e.g. API ID 32 C^®, bioMérieux) and molecular biological approaches. As an alternative to DNA‐dependent methods, mass spectral analysis based identification of micro‐organisms has become increasingly recognized. In a number of studies, matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry (MALDI‐TOF MS) has been applied for the rapid classification and identification of micro‐organisms. In this study, the applicability of MALDI‐TOF MS for identifying yeasts isolated from dermatological patients was analysed and compared with the results from the API ID 32 C^® system. Furthermore, sequencing the internal transcribed spacer (ITS) regions of the ribosomal DNA was employed as reference method. Candida (C.) albicans was isolated in 41.9% of all cases, C. parapsilosis in 20.3%, C. glabrata in 10.8%, and C. krusei in 6, 8.1%. Rarely isolated yeasts were Candida colliculosa, famata, guilliermondii, lusitaniae, and tropicalis as well as Geotrichum candidum, Rhodotorula mucilaginosa and Trichosporon mucoides. The MALDI TOF results were equal to the results gained by ITS sequence analysis in 94%, whereas API ID 32 C^® provided the correct diagnosis in 84.3% (of all cases). This lower identification rate is mostly referable to frequent misidentifications of C. krusei as C. inconspicua/norvegensis,Candida tropicalis, or Geotrichum capitatum. In contrast, all C. krusei strains were correctly identified by MALDI TOF MS. In conclusion, species identification by MALDI‐TOF MS was proven to be consistent with ITS sequence analysis; the technique has a resolving power comparatively as high as ITS sequence analysis.     

基于ITS2序列的滨海白首乌及其近缘种DNA分子鉴定

目的采用ITS2条形码鉴定滨海白首乌及其近缘种药用植物。方法采集滨海白首乌Cynanchum auriculatum及其近缘种植物样品共54份,分别提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载萝藦科植物16种47条序列,并通过ITS2数据库注释出ITS2序列;对提交与下载的101条序列,应用MEGA5.0软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建neighber-joining(NJ)系统进化树直观反映鉴定结果。结果滨海白首乌ITS2序列长度均为249 bp,是1个单倍型,与萝藦科鹅绒藤属植物距离较近,与萝藦科其他属近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示滨海白首乌及其近缘种药用植物均可明显区分,表现出良好的单系性,依据ITS2二级结构,也可以直观地将滨海白首乌与萝藦科近缘种区分。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别滨海白首乌,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

畲药搁公扭根基原植物及其同属易混种的ITS2条形码鉴别

目的基于ITS2条形码序列对畲药搁公扭根及其同属易混种进行分子鉴定,以保证药材使用的正确性和临床疗效。方法分别于浙江、广西、江西和安徽等地采集搁公扭根基原植物掌叶覆盆子及其9种同属易混种高粱泡、山莓、蓬蘽、茅莓、插田泡、寒莓、东南悬钩子、三花悬钩子和武夷悬钩子样品共140份。对采集样品进行基因组DNA提取、ITS2基因片段PCR扩增并双向测序、拼接获得相应序列,基于HMMer方法注释获取ITS2序列,同时下载Gen Bank相应物种ITS2序列37条,使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度、GC量、变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA7.0软件计算种内、种间遗传距离,构建邻接(NJ)系统发育树。结果搁公扭根及其9种同属易混种ITS2序列长度为211~213 bp,GC量为52.1%~58.0%;搁公扭根基原植物与其他物种共有14个变异位点,一处插入/缺失;搁公扭根种内平均K2P遗传距离为0.007 2,显著小于其他9个易混种,其中与山莓和武夷悬钩子进化距离最近,与蓬蘽最远;NJ进化树中搁公扭根各单倍型序列单独聚为一支,可与其他物种成功区分。结论 ITS2序列能够成功鉴别搁公扭根基原植物及其9种同属易混种,为畲药DNA条形码分子鉴别提供了有力佐证,助力畲药流通信息监管。     

药用植物三尖杉及其同属易混物种的DNA条形码鉴定研究

目的：探索建立适用于鉴定药用植物三尖杉及其同属易混物种的DNA条形码鉴定体系,以保障其用药安全。方法：提取三尖杉属3个物种（三尖杉、粗榧和篦子三尖杉）共22份样本的基因组DNA、扩增ITS2和psbA-trnH 序列并测序,通过CodonCode Aligner V4.2对测序峰图进行校对拼接。应用MEGA 5.1计算种内和种间Kimura 2-Paramter（K2P）遗传距离,构建邻接（Neighbor-Joining, NJ）系统聚类树。结果：基于ITS2序列分析,三尖杉的种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离;基于psbA-trnH 序列分析,三尖杉的种内和种间遗传距离有重合。结论：应用ITS2序列,可以实现对三尖杉及其易混物种的鉴别,为三尖杉药材的安全使用提供鉴定依据。