杭州市2019年登革病毒分子流行病学研究

目的 了解2019年杭州市登革病毒分子特征和可能的传播来源。方法 收集登革热患者血清样本,分析登革热流行特征。分别采用ELISA和RT-PCR方法检测登革热抗体、登革病毒核酸及其型别,再对核酸阳性样本进行E基因扩增、序列测定和进化分析。结果 2019年杭州共检测登革热病例212例(输入性病例158例,本地病例54例),其中65例IgM抗体检测阳性,178例DENV通用型核酸检测阳性。输入性病例中4种血清型登革病毒均有检出,以DENV-1为主(占51.9%)。本地病例多由DENV-1基因I型(6/54)、IV型(26/54)和DENV-2 Cosmopolitan基因型(2/54)病毒引起,E基因序列分别与2019年广州和南昌流行株、2015年菲律宾株和2018年泰国株同源性较高。其中DENV-1基因IV型本地流行病毒的E基因序列高度同源,序列相似性高达99.9%~100%,推测为多起输入性病例引起的本地传播。结论 受东南亚登革热疫情影响,杭州2019年登革热病例数量增幅明显,呈型别多样化、本地病例溯源复杂的特点,需进一步加强DENV分子特征研究。     

免疫荧光技术检测室内感染蚊虫体内登革病毒的研究

目的　探讨检测媒介蚊虫体内登革病毒的方法。　方法　以埃及伊蚊和白纹伊蚊两种有效媒介为研究对象 ,在人工经口感染大剂量登革 2型病毒 (DEN- 2 )的基础上 ,通过蚊细胞培养病毒分离和蚊头部压片免疫荧光技术进行病毒抗原检测。　结果　埃及伊蚊感染 DEN- 2病毒 1d后 ,接种 C6 / 36细胞 ,盲传一代后第 5 d出现空斑现象 ,确证细胞发病。白纹伊蚊经口感染登革病毒后 ,取吸血雌蚊每日进行头部压片免疫荧光检测 ,结果显示 ,从蚊虫感染后第 1d～第 2 0d内均能检测到病毒抗原。　结论　用免疫荧光技术 ,可直接检测出感染蚊体内是否携带登革病毒 ,是较为简便、省时、敏感的方法     

2型登革病毒诱导RAW264.7细胞凋亡的机制及凋亡对病毒复制的影响

 目的：探讨2型登革病毒（DENV2）感染能否诱导RAW264.7细胞凋亡,并初步探讨凋亡对病毒复制的影响。方法：用DENV2感染RAW264.7细胞,MTT检测细胞活性,Hoechst 33342染色检测细胞核变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测caspase-3和caspase-8活化片段的变化,比色法检测caspase-9活性变化,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,Z-VAD-FMK抑制细胞凋亡后以TCID50检测感染细胞上清病毒滴度。结果：DENV2感染RAW264.7细胞24 h、36 h及48 h后细胞活性受到抑制,免疫荧光检测有核固缩现象,流式细胞术检测发现病毒感染诱导了细胞凋亡,Western blotting检测发现活化caspase-3和caspase-8的表达增加,caspase-9活性也增加,JC-1染色发现病毒感染诱导RAW264.7细胞线粒体膜电位降低,用Z-VAD-FMK抑制凋亡后感染细胞上清病毒滴度增加。结论：登革病毒感染可以通过内、外源性途径诱导RAW264.7细胞发生凋亡;凋亡发生抑制了病毒的产生。     

喜炎平注射液抗Ⅱ型登革病毒作用的体内及体外实验研究

目的 分别通过体外和体内实验研究喜炎平注射液对Ⅱ型登革病毒（Dengue virus serotype 2, DENV2）的抗病毒作用。方法 体外实验以利巴韦林注射液作为阳性对照药物,分别以灭活、抑制进入、治疗性给药以及预防联合维持治疗的方式处理人肝癌细胞株HepG2细胞,在不同时相点收获上清和细胞,分别利用间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测DENV2的病毒载量,从而评价喜炎平注射液的体外抗DENV2作用。体内实验以SCID小鼠为实验鼠,腹腔注射HepG2细胞,建立模型小鼠,腹腔注射感染DENV2,次日给予不同剂量（1、2、4 mg/只）的喜炎平注射液,连续给药4 d,部分小鼠于感染第6日取材,利用IFA检测实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并观察实验鼠的生存率。结果 体外实验显示,喜炎平注射液能够灭活DENV2,并抑制DENV2进入细胞,同时无论是治疗还是治疗联合预防给药,均可对DENV2的复制具有良好的抑制作用,即在病毒感染早期及晚期,喜炎平均可发挥抗病毒作用,且优于利巴韦林。进一步在体内实验中同样显示喜炎平具有较好的抗病毒作用,可以降低实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并可提高实验鼠的生存率。结论 喜炎平注射液具有明显的抗DENV2病毒的作用,可为DENV感染的治疗提供新的候选药物。     

青蒿琥酯在细胞水平抑制登革病毒的研究北大核心CSCD

目的研究青蒿琥酯在细胞水平抑制Ⅱ型登革病毒(DENV-Ⅱ)复制的效应。方法通过CCK-8法测定青蒿琥酯和利巴韦林对HepG2细胞的最大无毒剂量;通过空斑法、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测评价青蒿琥酯抑制DENV-Ⅱ复制效应。结果 CCK-8试验测定青蒿琥酯和利巴韦林对HepG2细胞的最大无毒剂量分别为30μmol/L和50μmol/L。空斑试验显示青蒿琥酯能抑制DENV-Ⅱ粒子的释放(F=20.07,P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示青蒿琥酯和利巴韦林均能抑制DENV-ⅡRNA的复制(F值分别为9.928和107.2,均P<0.05),qPCR评价其半数有效抑制浓度(EC50)分别为28.89μmol/L和20.61μmol/L。蛋白免疫印迹试验显示青蒿琥酯能抑制DENV-Ⅱ包膜蛋白E的表达(F=24.23,P<0.05)。检测不同时间点给药,实时荧光定量PCR结果显示在病毒感染2 h后给药有抑制DENV-Ⅱ病毒复制效应(F=3.621,P<0.05)。结论青蒿琥酯能从细胞水平上抑制DENV-Ⅱ病毒的复制。     

中国开展大规模灭蚊行动严控登革热蔓延之势

<正>2014年10月8日,一场以防蚊灭蚊为重点的卫生行动在广东全省统一展开,以控制登革热的扩散蔓延。据广东省卫生计生委消息,截至10月8日0时,今年全省共有20个地级市累计报告登革热24 489例,过去几天广东每天报告的新增病例均超过1 000例。中国疾病预防控制中心的统计显示,全国已有23个省份报告登革热病例,病例数     

登革热诊疗指南(2014年第2版)

登革热是由登革病毒引起的急性传染病,主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。一、病原学登革病毒属黄病毒科黄病毒属。登革病毒颗粒呈球形,直径45~55nm。登革病毒共有4个血清型(DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4),4种血清型均可感染人,其中2型重症率及病死率均高于其他型。登革病毒对热敏感,56℃30分钟可灭活,但在4℃条件下其感染性可保持数周之久。超声波、紫外线、0.05%甲醛溶液、乳酸、高锰酸钾、龙胆紫等均可灭活病毒。病毒在pH 7~9时最为稳定,在-70℃     

四种病毒灭活方法用于登革病毒灭活效果的比较

目的评价常用病毒灭活方法对血液制品中登革病毒(DENV)的灭活效果。方法将单采新鲜冰冻血浆(FFP),人凝血因子Ⅷ(FⅧ)和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)3种血浆及其制品中加入高滴度(8.00-9.25)的登革病毒液,分别采用亚甲蓝(MB)光化学法灭活FFP、有机溶剂/去污剂(S/D)法灭活FⅧ、低pH常温孵化法和巴氏消毒法灭活IVIG;以1×10~6/mL A549细胞接种于T25的培养瓶中作为病毒传代及滴度滴定指示细胞,将灭活前后的血浆及制品接种于A549细胞并检测其DENV滴度,并通过qRT-PCR对DENV RNA做定量检测;评估不同的灭活方法对DENV的灭活效果。结果 DENV滴度下降:MB光化学法灭活FFP下降滴度≥5.92 log,S/D法灭活FⅧ下降滴度≥5.17 log、巴氏法和低pH法灭活IVIG均下降滴度≥5.92 log,其中MB光化学法灭活FFP、SD灭活FⅧ及巴氏法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低1.25 log-2.25 log,低pH法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低0.17 log。所有血浆和血液制品样品经灭活后,在DENV宿主细胞上3代盲传后均未检测到DENV RNA。结论 4种常用病毒灭活方法均能有效灭活血浆及血液制品中的DENV。     

4型登革病毒NS2A蛋白通过UXT-V1逃避宿主免疫的机制研究

目的探讨4型登革病毒NS2A蛋白通过泛转录表达因子剪接变异体1(UXT-V1)逃避宿主免疫的机制。方法在HEK-293T细胞中,4型登革病毒感染后过表达NS2A蛋白,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测干扰素-β(IFN-β)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素诱导蛋白54(ISG54)的表达量;通过荧光素酶报告实验检测NS2A蛋白对IFN-β与核因子κB(NF-κB)通路的影响;通过免疫共沉淀检测NS2A蛋白与UXT-V1的相互作用;通过核蛋白抽取检测IRF3和p65的核定位。结果4型登革病毒NS2A蛋白与宿主UXT-V1存在相互作用。此外,4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β、IL-8和ISG54的mRNA水平,阻断IRF3和p65的核转移,抑制宿主IFN-β与NF-κB通路。结论4型登革病毒NS2A蛋白通过与UXT-V1的相关作用阻断宿主固有免疫关键因子IRF3和p65的核定位,抑制宿主IFN-β与NF-κB通路,最终到达其免疫逃避的目的。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT-PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法.方法 设计合成LNA探针,替代MGB探针,建立一步法TaqMan RT-PCR方法,并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化;用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA,以优化的TaqMan RT-PCR方法进行检测,比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性.结果 LNA探针TaqMan RT-PCR有较好的PCR扩增效率(104%)、较广的线性范围(10 0～10-7样品稀释度)、较高的敏感性(0.003TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于4.53%),新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性(0.03TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于6.36%).结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT-PCR反应,简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT-PCR可满足登革病毒快速检测的需要.