Multiplexed assay panel of cytotoxicity in HK-2 cells for detection of renal proximal tubule injury potential of compounds

Proximal tubules of the kidneys are one of the most common targets of nephrotoxic drugs and chemicals. Screens to predict nephrotoxic potential of compounds with insights to mechanisms of toxicity facilitate lead optimization, guide structure-activity relationships, minimize risks of clinical nephrotoxicity and therefore are valuable in the process of drug discovery. We developed and characterized an in vitro assay multiplexed to measure several endpoints of cytotoxicity using HK-2 cells. Assays for lactate dehydrogenase, cellular caspase 3/7 activation, resazurin dye reduction and Hoechst 33342 DNA staining were multiplexed to maximize the ability to detect cell injury. Assays were performed after 5- or 24-h incubations to further enhance the sensitivity of detection of toxicity. Individual assays were optimized for cell density, assay linearity and assay performance under multiplexed conditions. Inducers of apoptosis (staurosporine) and necrosis (perhexiline) were used to validate the mechanistic aspects of cell death. Nephrotoxic compounds (5-fluorouracil, gentamicin, cisplatin, acetaminophen, para-aminophenol, potassium dichromate, ibuprofen, doxorubicin, cyclosporine, citrinin, puromycin) were used to determine the potential of this method to detect proximal tubule toxicity of compounds. Overall, this cost-effective multiplexed platform is more sensitive than a single endpoint assay, provides mechanistic cues of toxicity and is amenable for higher throughput screening.     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

革兰阴性杆菌中质粒ampC基因的检测与分析

目的　运用多重聚合酶链反应 (PCR)检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因。 方法　通过热裂解获得DNA模板 ,用 6组引物进行多重PCR扩增 ,用琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物。结果　 2 0 0株临床分离的革兰阴性杆菌中有 6株为质粒ampC基因阳性。 结论　用多重PCR技术能简单、快速地检测革兰阴性杆菌质粒ampC基因 ,且特异性高。     

应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

莫西沙星耐药的艰难梭菌多重聚合酶链反应检测和基因分型

目的：建立一种多重 PCR 方法用于莫西沙星耐药的艰难梭菌鉴定和初步基因分型。方法根据艰难梭菌 slpA 可变区间核苷酸序列的差异设计5种 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的特异性 PCR 引物,同时加入检测艰难梭菌管家基因磷酸甘油醛异构酶基因 tpi 的种特异性引物,构建多重PCR 方法;利用9种肠道常见的正常或致病菌验证多重 PCR 方法的特异性,利用46株分属于11个slpA 基因型的艰难梭菌参考菌株来验证方法的检测和分型能力;利用建立的多重 PCR 方法检测39株莫西沙星耐药的临床菌株,以 slpA 测序分型法为参照方法,评估该方法的临床实用性。结果多重PCR 检测9种肠道常见的正常或致病菌 tpi 和5种 slpA 基因型均为阴性;46株艰难梭菌参考菌株 tpi均为阳性,36株分属于5种靶 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的菌株被正确分型,10株分属于其他6种基因型的参考菌株均无法分型。39株莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株 tpi 均为阳性,32株检出具体基因型,其中22株为 slpA 基因型 gc08,6株为 hr,2株为 fr,2株为078,与 slpA 测序分型结果一致;7株多重 PCR 无法分型,slpA 测序分型结果显示其基因型均不包含在多重 PCR 分型范围内。结论成功建立一种简单、快捷、临床实验室适用的艰难梭菌检测,且能够分辨出5种 slpA 基因型的多重PCR 方法;莫西沙星耐药的艰难梭菌主要为 slpA 基因型 gc08。