体外辐射模拟P53依赖的小鼠肠干细胞损伤研究

目的 建立6 Gy小鼠肠干细胞体外辐射模型,模拟在体P53依赖的肠干细胞辐射损伤修复过程.方法 分离C57BL/6(野生型)、P53-/-小鼠小肠隐窝,分别于基质胶内接种进行3D培养,24 h后予X线6 Gy照射.比较两组隐窝克隆出芽过程和照后6d克隆存活率.对野生型隐窝克隆用RT-PCR检测照后24 h内不同时间点P53靶基因Bax、Bbc3、Mdm2、P21、Bcl2l1以及肠干细胞特征性基因Lgr5、Olfm4、Ascl2的表达.结果 C57BL/6和P53-/-小鼠小肠隐窝于接种后48 h出芽,在接种后96 ～ 120 h形成类器官样结构.6 Gy辐照可诱导C57 BL/6隐窝细胞24 h内大量死亡,完全抑制克隆出芽,仅(43.84 ±5.73)％的克隆存活;而对P53-/-小鼠隐窝出芽时间无影响,且有(83.69±5.89)％隐窝克隆存活,显著高于对照组(P＜O.01).在野生型隐窝克隆中,P53下游靶基因的表达可被辐射迅速激活,并在24 h内维持高水平,而干细胞特征性基因在12h迅速下降,24 h到达最低水平.结论 6 Gy照射小鼠小肠隐窝能较好地模拟在体P53依赖的促凋亡因素对肠干细胞的损伤.     

睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立与生物学功能初步研究

目的 建立睾丸prolactin family 3,subfamily c,member 1(Prl3c1)过表达转基因(TG)小鼠,并对其功能进行初步研究.方法 设计引物扩增insulin like 3(Insl3)、Prl3c1、Insl3PA片段,通过融合PCR,形成Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3 PA片段,构建pPrl3c1转基因载体,测序验证.通过受精卵原核注射,建立TG小鼠.免疫荧光、Western blot方法鉴定转基因表达情况.采用ELISA方法检测3月龄TG小鼠与野生型对照(WT)小鼠睾酮基础水平;并测定5 U/10 g人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin,HCG)刺激后,TG与WT小鼠睾酮水平(n=6).结果 免疫荧光与Western blot检测结果表明转基因片段表达于TG小鼠睾丸间质细胞.TG小鼠睾丸形态学未见明显异常.此外,TG小鼠基础睾酮水平与WT小鼠差异无统计学意义[(2.61 ±0.34) ng/mL vs (2.51 ±0.35) ng/mL,P＞0.05],但在HCG刺激后,TG小鼠睾酮水平低于WT小鼠[(5.35±0.83) ng/mL vs(7.56±1.17) ng/mL,P＜0.01].Western blot检测结果表明Prl3c1过表达减弱HCG刺激的STAR表达(P＜0.01).结论 成功建立了Prl3c1 TG小鼠,体内功能研究显示Prl3c1参与睾酮产生.     

循环内皮细胞对冠心病心血管事件的预测价值

目的 探讨循环内皮细胞(CEC)计数成为急性冠脉综合征(ACS)患者心血管风险预测的重要生物标志的有效性.方法 研究分析了110例ACS患者和30例健康人群作对照(HC组);根据其病史、症状、心电图、各种生化结果,利用两种不同的冠心病风险评分系统评估ACS患者的心血管事件风险:心肌梗死溶栓治疗临床试验(TIMI)评分评价非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)/不稳定型心绞痛(UA)以及ST段抬高型心肌梗死(STEMI);全球急性冠状动脉事件注册(GRACE)评分评价所有冠心病;利用流式细胞仪检测静脉血CEC数.结果 与HC组比较,ACS患者组的CEC计数明显升高,并随疾病的严重程度进行性升高;CEC计数和心血管事件风险的高低明显相关,TIMI UA/NSTEMI、TIMI/STEMI、GRACE评分相关系数分别为0.47、0.64、0.61(P<0.05);CEC诊断急性心肌梗死中度可靠,受试者工作特征曲线下面积(AUC)=0.90(95% CI:0.84~0.94, P<0.01);CEC计数诊断ACS中度可信,AUC=0.89(95% CI:0.82~0.93,P<0.01) .结论 CEC计数的升高和ACS患者心血管事件的高风险密切相关,CEC可能成为心血管事件的有效预测因子.     

蓝莓花青素对由H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 通过建立人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）氧化应激损伤细胞模型,探讨蓝莓花青素是否能够对H₂O₂引起的细胞损伤具有保护作用。方法 采用过氧化氢（H₂O₂）创建ECV304氧化应激损伤细胞模型,实验分为正常对照组、H₂O₂组、蓝莓花青素低、中、高剂药物组,药物组中加入蓝莓花青素培养2h后,再加入H₂O₂继续培养6h,采用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期变化情况及细胞凋亡率。结果 细胞活力与H₂O₂浓度及其作用的时间呈相关性下降趋势,在一定浓度范围内蓝莓花青素对细胞具有保护作用。结论 蓝莓花青素对由H₂O₂引起的氧化应激损伤具有一定保护作用。     

细胞密度对卵巢癌干细胞悬浮球诱导的影响

目的 研究细胞密度是否会对从人卵巢透明细胞癌系ES2 和卵巢腺癌细胞A2780中分离的癌干细胞产生影响。方法 将ES2、A2780细胞置于含生长因子、牛血清白蛋白和人胰岛素的无血清培养基中培养,采用连续传代诱导培养癌干细胞。观察不同细胞密度下ES2、 A2780细胞形态变化,流式细胞术分别检测含血清培养基（SSM）组、无血清培养基（SFM）组细胞诱导前后细胞表面标志CD133、CD44表达的改变。软琼脂克隆形成实验检测不同诱导条件下ES2癌干细胞球生长速度和成瘤能力。结果 2×104 mL-1密度下,ES2细胞能在SFM中存活,但不能形成癌干细胞球;5×104、1×104 mL-1 ES2细胞能在SFM中存活、增殖并形成癌干细胞球。与贴壁的细胞及诱导前相比,诱导后形成的癌干细胞球（1×105 mL-1组、5×105 mL-1组）高表达CD133+、CD44+ （ P<0.05）,传代后具有更高的增殖能力和克隆形成能力,且5×104 mL-1密度下,癌干细胞球成瘤能力更强。A2780细胞分别以1×104、3×104、5×104 mL-1的密度接种于SFM中,10 d后,1×104、3×104 mL-1组中形成细胞团,但3×104 mL-1组中形成的细胞团更大,透光性更强,细胞更致密,5×104 mL-1组未形成细胞悬浮球。流式细胞术发现A2780细胞3×104 mL-1组中细胞与1×104 mL-1组相比,CD133+细胞阳性率更高,差异有统计学意义( P<0.05)。3×104 mL-1组的细胞生长速度最快。结论 细胞密度5×104 mL-1和3×104 mL-1分别是诱导ES2、 A2780细胞株卵巢肿瘤干细胞球的合适条件。     

乙酰水杨酸对牙龈干细胞免疫调节功能的促进作用

目的 检测乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid,ASA)对牙龈干细胞(mesenchymal stem cells derived from gingiva,GMSCs)免疫调节功能的影响,初步探索乙酰水杨酸对干细胞治疗免疫相关疾病疗效的提高作用及机制。方法 通过流式细胞仪分析ASA对GMSCs干细胞表面标志分子CD146、CD105、CD90、CD34 和 CD45的影响,通过BrdU掺入法以及MTT细胞实验检测GMSCs增殖率。建立 GMSCs与T细胞体外共培养系统,通过流式细胞仪分析细胞凋亡并用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测相关炎症因子。进一步建立硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)诱导性小鼠肠炎模型,通过追踪小鼠体重等临床表现以及结肠病理组织切片,研究GMSCs注射对DSS诱导肠炎的治疗作用,以研究ASA对GMSCs免疫调节功能的促进作用,并进一步探索其分子机制。结果 ASA促进GMSCs增殖并调高CD146及CD105等干细胞表面标记分子在GMSCs的表达。GMSCs与T细胞共培养中,GMSCs诱导T细胞凋亡,ASA可以增强GMSCs诱导T细胞凋亡,同时抑制T细胞分泌炎症因子干扰素γ和肿瘤坏死因子α。GMSCs注射对DSS诱导性小鼠肠炎具有治疗作用,表现为小鼠体重下降减缓、肠炎临床指数降低、结肠组织切片HE染色显示炎性细胞浸润减少及病理指数降低,ASA可以促进GMSCs注射治疗小鼠肠炎疗效。分子机制上,ASA通过调高Fas/FasL信号通路FasL的表达促进GMSCs诱导T细胞凋亡。结论 ASA增强GMSCs免疫调节功能,促进GMSCs对小鼠诱导性肠炎的治疗作用。     

外科植入引导牙周组织再生载药PLGA/CS/nHA复合膜的制备及表征

目的 制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)/壳聚糖(CS)/纳米羟基磷灰石(nHA)多孔性载药膜,用于外科植入牙周引导组织再生,并评价其体外性能.方法 按照PLGA/CS的质量比将实验设为4组:分别为100/0、90/10、80/20、70/30,采用冷冻干燥法制备PLGA/CS/nHA复合膜,并用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为致孔剂.依据孔隙率、吸水率、力学性能、体外降解率筛选出最优质量比的PLGA/CS/nHA复合膜作为药物载体,制备克林霉素缓释膜.采用扫描电子显微镜观察PLGA/CS/nHA复合膜的表面形貌,无水乙醇液体置换法检测复合膜的孔隙率,质量干湿率比考察复合膜的吸水率,电子万能材料实验机测试复合膜的湿态力学性能,质量损失考察膜的降解率,紫外分光光度法考察载药膜的体外药物释放特性.体外实验:在载药膜上接种牙周膜成纤维细胞(PLFs),培养1～7 d,采用CCK-8法测定细胞活性和增殖情况.结果 PLGA/CS质量比为90∶10时制备的PLGA/CS/nHA复合膜最为理想,孔隙率为(28.66±1.35)％,吸水率为(108.65±2.27)％,拉伸强度为(2.36±0.04) MPa,断裂伸长率为(203.64±3.89)％,断裂力为(45.98±2.46)N,30 d时降解率为(17.60±0.86)％,最大每日释放量为150 μg/mL,平稳释放药物并维持有效药物浓度时间＞15 d,载药膜能促进牙周膜成纤维细胞的增殖.结论 本研究制备的载药PLGA/CS/nHA复合膜孔隙率适中,体外降解与组织生长相适应,力学测试结果能够创造和维持牙周引导组织生长特定的空间,在一定时间内能持续稳定释放药物.     

Msp对人非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的 实验研究

目的 探讨巨噬细胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein, Msp)对人非小细胞肺癌细胞株PC14增殖、迁移和侵袭能力影响的研究。方法 构建Msp编码基因st1 真核表达载体,将st1 导入Msp（-）和RON（-）人非小细胞肺癌细胞株PC14,并用G418筛选出稳定表达的细胞株。通过RT-PCR方法检测已转染st1 载体PC14细胞中st1 的表达,用Western blot检测Msp在PC14、PC14-st1 -pEGFP-N1、PC14-pEGFP-N1中的表达水平,同时检测RON在PC14和RON(+)细胞SKBR-3中的表达情况。通过计算RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞）和SKBR-3细胞在各转染组细胞培养上清液的刺激下穿过Transwell 微孔膜的细胞数来评价Msp的生物学活性。利用MTT法检测Msp对PC14细胞增殖力的影响,采用Transwell小室和基质胶侵袭实验观察Msp对PC14细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 转染st1 基因后,形成PC14-st1 -pEGFP-N1,稳定表达st1 mRNA及蛋白,其本身的增殖能力被明显抑制,迁移能力和侵袭能力均较PC14和PC14-pEGFP-N1降低。它还通过旁分泌的方式对RON (+)阳性的癌细胞RAW264.7和SKBR-3的迁移起促进作用。结论 Msp表达可降低人非小细胞肺癌细胞PC14的增殖、迁移和侵袭能力,却对RON (+)阳性的癌细胞迁移通过旁分泌的方式有促进作用。     

小分子化合物影响神经干细胞再生的思考

近年来有不少研究兴趣聚焦于基于神经干细胞治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）等神经退行性疾病的策略。到目前为止,所谓的再生医学主要集中于用多能胚胎干细胞进行细胞移植治疗。虽然已经有了一些令人激动的研究结果,但胚胎干细胞替代治疗仍然面临一些障碍,包括免疫排斥、突变带来的过度生长、伦理学争论等。代之而起的探索是用小分子化合物直接调制内源性干细胞的命运,已经取得一些结果,但许多涉及神经干细胞与局部小环境的相互作用及神经干细胞特异性信号机制的基础问题有待阐明。对这些问题的研究可能深化对神经干细胞生物学的认识,并促进创新性治疗药物的问世。     

干细胞移植治疗脊髓损伤的研究

脊髓损伤是一种由外伤、感染、缺血或相关病变累及引起的难治性中枢神经系统疾病,具有极高的致残率和致死率.传统的营养神经药物、理疗及对症治疗效果欠佳,已有动物研究和临床试验证明干细胞移植是一项有望修复脊髓损伤的策略.研究干细胞治疗脊髓损伤的修复机制、现状及最新进展可为脊髓损伤开辟全新的治疗思路.