miR-25对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的作用

目的:探讨微小RNA-25(miR-25)在缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡过程中的作用及机制。方法:构建miR-25高表达H9c2细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,real-time PCR检测miR-25及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA的表达,Western blot检测HMGB1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化,明确miR-25的高表达对缺氧/复氧所诱导的H9c2细胞凋亡及HMGB1表达的影响。然后通过双萤光素酶报告基因验证miR-25与HMGB1的靶向关系,并构建转染HMGB1 shRNA的H9c2稳定细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,验证HMGB1是否参与缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的调控。结果:与对照组相比,高表达miR-25组的H9c2细胞在缺氧/复氧诱导后HMGB1表达下调,Bcl-2表达上调,cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术提示处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.01)。双萤光素报告基因显示,转染miR-25 mimic+野生型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性明显下降;转染miR-25 inhibitor+野生型HMGB1-3’UTR和转染miR-25 mimic+突变型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性没有变化。转染HMGB1-shRNA的H9c2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术分析提示细胞凋亡减少,处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.05)。结论:miR-25减少缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡,期作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。     

基于HepG2细胞胰岛素抵抗模型探讨miR-7-5p对Itch基因的靶向作用

目的:通过体外建立Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,检测胰岛素抵抗状态下微小RNA-7-5p(miR-7-5p)及其预测靶基因Itch的差异表达,初步探讨miR-7-5p对Itch基因的靶向作用及其与胰岛素抵抗的关系。方法:采用适宜浓度的软脂酸诱导Hep G2细胞,建立体外胰岛素抵抗模型;基于生物信息学分析预测miR-7-5p可能作用的靶基因及其富集的相关信号通路;运用RT-q PCR和Western blot技术检测在胰岛素抵抗状态下miR-7-5p和Itch的表达变化。结果:0.25 mmol/L的软脂酸作用于Hep G2细胞24 h可诱导细胞产生胰岛素抵抗,RT-q PCR检测表明,与阴性对照组相比,胰岛素抵抗组的miR-7-5p表达下调(P0.01)。生物信息学分析结果表明,miR-7-5p有相当数量的靶基因富集于泛素-蛋白酶体系统,其中E3泛素连接酶Itch基因是与胰岛素抵抗最为相关的靶基因;Western blot结果揭示,在胰岛素抵抗状态下,Hep G2细胞中Itch蛋白表达上调(P0.01)。结论:miR-7-5p可能参与了胰岛素抵抗的病理生理过程,其机制可能通过靶向调控Itch基因的表达,进而直接或间接影响胰岛素信号通路的正常转导。     

MicroRNA-141靶向Keap1调控Nrf2/ARE信号通路对乳腺癌T47D细胞活力的影响

目的:探讨微小RNA-141(miRNA-141)靶向Keap1调控Nrf2/ARE信号通路对乳腺癌T47D细胞活力的影响。方法:乳腺癌T47D细胞分别转染miRNA-141模拟物(mimic)和阴性对照序列(NC),作为miRNA-141组和NC组,并设立未转染空白对照组,采用real-time PCR法检测细胞中miRNA-141的含量;MTT法与荧光探针2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法分别检测细胞活力和活性氧簇(ROS)水平;Western blot法检测胞质接头蛋白Keap1、核因子E2相关因子2(Nrf2)、超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化酶1(GPx1)的表达;双萤光素酶实验检测miRNA-141与Keap1的关系。结果:转染miRNA-141 mimic后,miRNA-141组的miRNA-141表达量明显增高,细胞活力、ROS水平和Keap1蛋白表达均下降,而细胞核Nrf2蛋白SOD2和GPx1表达升高(P0.05);双萤光素酶实验结果显示Keap1为miRNA-141的靶基因。结论:miRNA-141可能通过靶向负调控Keap1激活Nrf2/ARE信号通路,诱导抗氧化酶的表达,以降低细胞氧化应激水平,从而抑制乳腺癌细胞的活力。     

miR-24对肺癌A549细胞化疗敏感性的影响

目的:探究微小RNA(miR)-24对肺癌细胞A549化疗敏感性的影响及可能的作用机制。方法:Real-time PCR实验检测肺腺癌细胞系A549及肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达情况。转染miR-24抑制序列(miR-24 inhibitor)下调A549/DDP细胞中的miR-24后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、细胞色素C(Cyt C)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)和P53的蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验预测及验证miR-24可能的靶基因。结果:耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达水平明显高于A549细胞(P0.05)。miR-24 inhibitor可诱导肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的凋亡,增加细胞对顺铂的敏感性;此外还可下调Bcl-2/Bax比值,同时上调P53、p-ERK、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及Cyt C的蛋白水平。而应用ERK特异性抑制剂U0126可部分恢复miR-24 inhibitor转染的细胞活力。生物信息学分析显示p53是miR-24的可能作用靶点基因,在A549/DDP细胞中共转染miR-24 inhibitor和P53 siRNA可部分逆转miR-24 inhibitor对细胞活力的影响。结论:下调肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达可增加细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与靶向p53基因同时激活ERK/P53信号通路后促进细胞经线粒体途径的凋亡有关。     

miR-7敲减CD4~+ T细胞过继转输对小鼠急性肝损伤模型的影响

目的:观察过继转输微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(knockdown,KD)CD4~+ T细胞对小鼠急性肝损伤模型的影响,并探讨其意义。方法:利用磁珠分选技术分别获得正常野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠脾脏中CD4~+ CD62L~+ T细胞;CFSE染色标记后,按每只小鼠2×10~6个细胞,经尾部静脉注射给同系WT小鼠,并利用伴刀豆球蛋白A建立急性肝损伤模型;观察过继转输后2组小鼠肝脏的形态、重量及其重量指数的变化;HE染色观察小鼠肝脏组织的病理学变化;real-time PCR检测小鼠肝脏组织中凋亡相关分子Bax和P53的表达;流式细胞术检测小鼠肝脏组织中CFSE标记的CD4~+ T细胞活化相关膜分子CD62L表达水平以及细胞因子白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的表达变化。结果:与对照组相比,过继转输miR-7KD小鼠CD4~+ CD62L~+ T细胞组(miR-7KD转输组)小鼠的肝脏重量明显减轻(P0.01),但重量指数显著增加(P0.05);HE染色显示miR-7KD转输组的肝脏细胞损伤增加;real-time PCR结果显示miR-7KD转输组肝脏组织中凋亡相关细胞分子Bax和P53的相对表达水平均明显升高(P0.05);流式细胞术检测结果进一步显示肝脏组织中的CFSE~+细胞活化相关分子CD62L的表达水平明显降低(P0.01),细胞因子IFN-γ的表达水平明显增加(P0.05),而IL-4的表达水平显著降低(P0.01)。结论:过继转输miR-7敲减CD4~+ T细胞可显著加重急性肝损伤模型小鼠的肝组织损伤。这为后续深入探讨急性肝损伤的发生机制提供了重要的实验基础。     

长链非编码RNA PVT1调控miR-551通过Wnt信号通路对卵巢癌迁移和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA PVT1在卵巢癌组织中的表达情况及其在卵巢癌细胞迁移和侵袭过程中的作用及机制。方法:q PCR检测卵巢癌和正常卵巢组织及不同卵巢癌细胞中PVT1的表达情况;Transwell侵袭实验和细胞划痕实验分别检测沉默PVT1后卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的变化;双萤光素酶报告基因检测PVT1与微小RNA(miR)-551的相互作用;Transwell侵袭实验和细胞划痕实验分别检测沉默PVT1后miR-551-inhibitor对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot法检测沉默PVT1后Wnt信号通路相关蛋白的表达情况。裸鼠皮下成瘤实验检测沉默PVT1对卵巢癌成瘤重量及体积的影响。结果:与正常卵巢组织相比,卵巢瘤组织中PVT1表达明显增高(P0.05);卵巢癌细胞株ES-2中PVT1表达水平最高(P0.05);沉默PVT1可以抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;PVT1能与miR-551的位点特异性结合;沉默PVT1后,miR-551-inhibitor可以促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;沉默PVT1后Wnt信号通路蛋白的表达相应下调;与阴性对照组相比,PVT1-siRNA组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量都明显减小(P0.05)。结论:PVT1在卵巢癌发生发展过程中起重要作用,它可以靶向调节miR-551,通过Wnt信号通路调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。     

MicroRNA-1的心律失常调控作用

微小RNA（miRNA）是近年来新发现的一类小分子非编码RNA,其通过调节靶基因mRNA的稳定性或抑制翻译过程而发挥作用。miR-1在人类心脏中表达最为丰富,与心律失常的发生关系密切,有大量文献报道可通过调节其表达而上调或下调多种心脏电活动相关离子通道或蛋白水平来调控心律失常。本文就miR-1调控心律失常的作用机制作一综述。     

MicroRNA-126与胃癌患者放化综合治疗效果的关系及其对胃癌SGC-7901细胞的放射增敏作用

目的:研究microRNA-126与胃癌患者放化综合治疗疗效的关系及其对胃癌细胞的放射增敏效果。方法:选取2014年6月~2015年6月间我院收治的晚期胃癌患者60例为研究对象,其中男性32例,女性28例,年龄37~65岁,平均年龄(51±7)岁。所有患者均接受放化综合治疗。收集患者的胃癌病理组织标本,同时于治疗结束时采集静脉血标本。采用国际实体瘤疗效评价标准(RECIST)评价患者的近期疗效,根据疗效将患者分为治疗敏感组和非敏感组。实时荧光定量PCR检测各组患者组织及血浆中microRNA-126的表达变化。体外培养胃癌SGC-7901细胞并转染microRNA-126 mimic;平板集落形成实验分析microRNA-126 mimic转染对SGC-7901细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测转染microRNA-126 mimic对SGC-7901细胞凋亡率的影响。结果:根据RECIST,共28例患者对治疗敏感,32例患者对治疗不敏感。与敏感组患者相比,不敏感组患者血浆和胃癌组织中的microRNA-126相对水平较低,相对于敏感组的倍数分别为0.72±0.04和0.48±0.03,差异具有统计学意义(P0.05)。MicroRNA-126 mimic转染后SGC-7901细胞的SF_2值和D_0值减小(P0.05),增敏比为1.74。流式细胞术分析结果发现,microRNA-126 mimic转染可以诱导SGC-7901细胞凋亡,并增加射线引起的细胞凋亡。结论:较低的microRNA-126提示胃癌患者放化综合治疗疗效不佳;microRNA-126具有增加胃癌细胞放射敏感性的作用。