Isolation of a peptide inhibitor of human rhinovirus

Cell culture-based transdominant genetic techniques provide new methods for discovering peptide/RNA modulators of cellular pathways. We applied this technology to isolate a peptide inhibitor of human rhinovirus. A green fluorescent protein (GFP)-scaffolded library of cDNA fragments was expressed in HeLa cells from a retroviral vector and screened for inhibitors of rhinovirus-mediated cell killing. A DNA clone, I421, increased cell survival in an HRV14 challenge assay from less than 0.5% to greater than 60%. It encodes a 53-amino-acid C-terminal extension of the GFP scaffold. Particular subclones of Hela cells expressing I421 (exemplified by I421dp3) show a delay in virus production and a 50-fold decrease in viral RNA levels at 6-8 h postinfection. HRV2, HRV14, and HRV16 show a dramatic decrease in plaque-forming ability on I421dp3 while Coxsackievirus B3 showed a small reduction. Levels of ICAM-1, the receptor for the main rhinovirus serotype, are not altered in I421dp3.     

cTnI( 28-110aa)-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的构建及表达人cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库中扩增出cTnI（28-110aa）和TnC基因，通过引物设计在两者之间加上linker序列即编码19个中性氨基酸残基TS-（G4S）3-AC的序列，克隆PCR产物，并构建成pET28a-cTnI（28-110aa）-linker-TnC表达质粒，转化人大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达，NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白的基因，并在大肠杆菌中实现可溶性高表达，在摇瓶中的表达量为20mg／L．经一步NTA树脂亲和层析纯化，获得条带单一的目的蛋白，采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实．目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法获得了具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白。     

中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫

目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。     

痘苗病毒VGF细胞膜外结构域在真核及原核细胞中的表达

目的为了进一步探索ＶＧＦ的生物学功能方法分别构建了痘苗病毒天坛株生长因子（Ｖａｃｃｉｎｉａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＧＦ）基因细胞膜外结构域（ＶＧＦｓｌ）的真核及原核表达系统，在相应的细胞中获得了单独表达（真核）和融合表达（原核）。结果初步纯化的ＶＧＦｓｌ表达产物能够与上皮生长因子（ＥＧＦ）的受体结合，并刺激受体中酪氨酸残基发生磷酸化反应。与ＥＧＦ相比，ＶＧＦｓｌ表达产物刺激ＥＧＦ受体自身磷酸化的能力更强。结论上述结果为ＶＧＦ在病毒感染过程中的作用以及ＶＧＦ作为新型多肽类药物的研究提供了有价值的线索。     

Development of retroviral vectors as safe, targeted gene delivery systems

The transfer of genes of potential therapeutic benefit is presently being attempted in the clinic to treat a number of genetic and virally induced diseases. Many of these protocols use retroviral vectors derived from murine leukemia retroviruses as gene delivery systems. Although these viral delivery systems are well suited for this purpose, a number of their characteristics, some of which are discussed here, are still troublesome. Future retroviral vectors will incorporate nonretroviral features and will be tailored to desired needs for specific uses. These vectors will be safer, more efficient, and targeted in their delivery. Further, expression of the therapeutic genes carried will be limited to the specific target cell type. Some of the recent advances that have been made towards this goal are reviewed here.     

一种含多个CCP结构域的新型基因的克隆及生物学特性初探

目的克隆并分析新型基因CCP22，研究其结构及初探生物学特性。方法常规分子克隆、生物信息学分析、Western blot、RT—PCR。结果利用酵母双杂交技术从人乳腺文库中分离到一种含有22个补体调控蛋白（complement control protein，CCP）序列元件的新基因，命名为CCP22。生物信息学分析发现，该基因定位于人染色体9q31．2-32，共15个外显子，基因编码序列全长4494bp，编码1497个氨基酸。将CCP22基因全长编码序列克隆于真核载体中，该表达载体转染人胚肾细胞293T后获得的表达产物经Western blot证实CCP22属于分泌蛋白。将CCP22与绿色荧光蛋白（EGFP）标签融合后证实CCP22主要分布在细胞核外。Northern blot证实，内源性CCP22 mRNA转录本全长约6kb。RT-PCR检测表明，CCP22在正常乳腺细胞株中高表达，而在多种乳腺肿瘤细胞株中不表达或低表达。结论CCP22在乳腺肿瘤发生发展中可能发挥重要作用。     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

人类一条新的类蛋白质二硫键异构酶cDNA的克隆和表达

利用SMART技术构建了人胎脑cDNA文库，通过大规模测序筛选出一条1645bp的人类cDNA。此cDNA含有一个888bp的开放阅读框（ORF），编码一个296个氨基酸的蛋白质，预测分子量34．0KD。与目前数据库中序列比较，该cDNA编码的蛋白质与蛋白质二硫键异构酶的同源性达36％，命名为类蛋白质二硫键异构酶（PDI－L）基因，多组织Northern blot分析显示PDI－L cDNA在心、脑、肝肾等组织中均有表达，该cDNA的读框片段正确插入到改造后的pBV220表达载体中，获得了预期的表达蛋白。