大鼠结肠上皮细胞分离及培养方法的建立

目的:建立大鼠结肠上皮细胞的原代培养方法,为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型.方法:采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10 mL、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25 min,分离上皮细胞团;吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含100 mL/L胎牛血清的完全培养基中,37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养.采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5 g/L的胰酶消化液消化并传代.结果:成功分离结肠上皮细胞团且活力较高.24 h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8 d逐渐融合成片,呈现明显的"铺路石"样.细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少.免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞.冻存处理复苏后细胞状态较佳.结论:通过该法可建立较稳定的大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台.     

急性肝损伤肝脏炎症环境对骨髓间充质干细胞移植疗效的影响

目的:探讨猪急性肝损伤肝脏内不同程度炎症反应对移植骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存活率和疗效的影响.8):对照组和移植组.每组均按照低浓度D氨基半乳糖胺(D-gal,0.25 g/kg)、高浓度D氨基半乳糖胺(D-gal,0.35 g/kg)给药,分别建立2种急性肝损伤模型,诱导24 h后,对照组动物门静脉注射生理盐水40 mL,移植组动物门静脉移植40 mL PBS(约8×107同种异体GFP-MSCs).2 wk内观察猪肝功能变化、病理变化、血清炎症指标和移植MSCs定植存活情况.结果:低浓度D-gal组血清IL-1、TNF-α水平明显低于高浓度D-gal组,差异有显著性.低浓度D-gal移植组与低浓度D-gal对照组比较,ALT、TB和NH3在早期有显著差异(D2:232.6±57.6 vs 334.4±42.3,12.2±3.3 vs 16.0±1.2,79.7±9.3 vs 127.8±28.2,P<0.05);高浓度D-gal移植组与高浓度D-gal对照组比较,肝功能指标有改善,但无显著意义.低浓度D-gal移植组MSCs定植存活率和肝细胞增殖率显著高于高浓度D-gal移植组.结论:骨髓间充质干细胞移植治疗肝损伤的疗效在很大程度上取决于肝脏炎症反应的程度,炎症反应越严重,移植细胞越不易存活;相反,较低的体内炎症环境有益于MSCs定植、存活和肝细胞再生.     

荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠肝细胞Bcl-2/Bax表达的影响

目的:研究荔枝核总黄酮(total flavone from Litchi Chinensis Sonn,TFL)对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响及作用机制.腔注射制备大鼠肝纤维化模型,造模的同时,TFL干预组分别以高、低剂量的TFL灌胃6wk进行干预治疗,空白对照组、秋水仙碱组分别以生理盐水、秋水仙碱灌胃作为阴阳性对照.HE及Masson染色观察肝纤维化程度;免疫组织化学二步法检测Bcl-2、Bax的表达;测定血清ALT、AST的水平.结果:模型组大鼠肝组织中Bcl-2、Bax的表达较正常组显著升高(P=0.000),TFL高、低剂量给药组及秋水仙碱组Bcl-2的表达较模型组升高(P=0.000,0.047,0.021),Bax的表达较模型组降低(P=0.000,0.014,0.007),TFL高剂量组与低剂量组比较Bcl-2的表达升高(P=0.018),Bax的表达显著降低(P=0.002).Bcl-2、Bax在秋水仙碱组与TFL低剂量组中的表达无显著性差异(P=0.726,0.767).肝纤维化严重程度与Bax的表达显著正相关(P=0.000);与Bcl-2的表达负相关(P=0.000).空白对照组、TFL高低剂量给药组及秋水仙碱组血清ALT、AST均明显低于模型组,具有显著性差异(P=0.000).低剂量组与秋水仙碱组无显著性差异(P=0.597,0.669).结论:TFL具有较好的抗肝纤维化和改善肝功能的作用,并推测这种作用可能与上调Bcl-2、下调Bax的表达,抑制肝细胞的凋亡有关.     

藤梨根提取物对大肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用及诱导凋亡的影响

目的:研究藤梨根提取物(ethanol extract from radix of actinidia chinensis,EERAC)对人大肠癌LoVo细胞增殖和凋亡的影响.方法:提取藤梨根抗癌有效活性成分(EERAC),按浓度分为4处理组(10、40、160、320mg/L)和空白对照组(0mg/L).各实验组经作用24、48、72h后,进行一般形态学和AO/EB荧光染色观察;MMT法检测细胞增殖的抑制情况;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法测定LoVo细胞中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达变化.结果:与空白对照组比较,一般形态学显示EERAC处理组能使细胞密度减低,增殖变慢;细胞逐渐变大,细胞间接触变松,胞浆中颗粒增多,细胞脱壁现象和周围碎片增多;荧光染色观察可见处理组细胞呈橙红色荧光,细胞核出现碎片状或固缩状的凋亡特征学形态改变,凋亡现象与EERAC的浓度呈正相关性;MTT法检测显示,EERAC处理组对LoVo细胞的最佳作用时间为72h,最大抑制率为79.48%,具有浓度和时间的依赖性(P<0.01);IHC检测结果显示EERAC作用LoVo细胞24h后,Bcl-2表达明显减弱,Bax、Caspase-3表达水平明显增高,Bcl-2/Bax比值下降,差异具有统计学意义(P<0.05),其效应与浓度相关.结论:EERAC具有明显抑制LoVo细胞增殖的作用,其机制可能与降低Bcl-2表达,上调Bax、Caspase-3的表达水平,激活线粒体凋亡途径有关.     

SCT引导下经皮细针穿刺细胞块对周围型肺部占位诊断价值

目的 探讨SCT引导下经皮细针穿刺细胞块检查对周围型肺部占位的诊断价值.方法 在SCT引导下进行定位穿刺,应用细胞块制作和免疫组织化学技术对42例未与胸壁粘连周围型肺部占位进行诊断.结果 明确病理诊断39例,其中肺癌34例,良性占位5例.结论 SCT引导下细针穿刺细胞块切片检查能够清晰显示细胞排列和组织结构,并且可多张切片做特殊染色和免疫组化染色,可组织定位和分型诊断;对周围型肺部占位有一定临床应用价值.     

中期因子对大鼠心肌梗死后心室重塑的保护作用

目的观察中期因子（MK）对大鼠急性心肌梗死（AMI）后心室重塑的影响。方法成年雄性Wistar大鼠48只,随机分为4组：空白对照组（Control组）、伪手术组（sham组）、梗死模型组（AMI组）和MK干预组（MK组）。结扎大鼠左冠状动脉前降支（LAD）,建立AMI动物模型。模型制备成功后,在环绕LAD周围注射MK为MK干预组。4周后,对大鼠行血流动力学指标检测,称重,计算全心体重指数;取组织制备标本,Masson染色鉴定胶原生成情况;免疫组化检测心肌微血管;TUNEL检测细胞凋亡数;Westernblot分析左心室内Bel-2蛋白、P—ERK1蛋白含量的表达。结果MK组大鼠心功能较AMI组得到明显的改善（P〈0．05）;全心体重指数较AMI组明显降低（3．788±0．630比4．725±0．610,P〈0．05）。sham组与Control组几乎无胶原形成,而AMI组与MK组有明显的胶原组织。在梗死及梗死周边区微血管数目MK组多于AMI组（30．662±1．794比15．275±0．389,P〈0．05）,心肌细胞凋亡率明显低于AMI组（27．2±3．2比47．8±4．5,P〈0．05）。MK组Bcl-2蛋白表达较AMI组增多（1．8748±1．0406比1．3637±0．2528,P〈0．05）,P—ERK1蛋白表达较AMI组增多（1．2751±0．6353比0．7862±0．5470,P〈0．05）。结论MK对大鼠心梗后心室重塑产生保护作用,其机制可能与MK上调了P—ERK1蛋白表达有关。     

经肝动脉注入脐带血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者25例疗效观察

目的探讨脐带血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者的安全性及对肝功能的改善作用.方法选择失代偿期肝硬化患者52例,随机分为治疗组25例和对照组27例.对照组行护肝治疗,治疗组在此基础上经股动脉插管至肝固有动脉注入脐带血干细胞治疗.治疗后第2周、4周和8周检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、凝血酶原时间（PT）和白蛋白（ALB）水平变化.同时观察临床症状的改善情况及术后的不良反应.结果治疗后第3天治疗组全部患者（100%）乏力、纳差症状改善,而对照组只有1例（4.0%）改善,两组间差异有显著性（P〈0.05）;治疗后8wk,治疗组和对照组血清ALB水平分别为35.2±8.5g/L和25.8±7.8g/L,具有显著性差异P〈0.05）,两组PTA分别为45.7±10.3%和37.9±11.8%,差异有显著性（P〈0.05）;血清ALT、AST、TBIL在两组间变化不明显.随访两组AFP水平未见明显差异,未发现严重的不良反应及并发症.结论脐带血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者有一定的疗效及安全性.     

The use of cell salvage in women undergoing cesarean hysterectomy for abnormal placentation

BackgroundAlthough transfusion of autologous blood obtained from cell salvage has increased, its role in obstetric practice remains controversial. This case series reports the use of cell salvage in an attempt to avoid allogeneic transfusion in women undergoing cesarean hysterectomy for placenta accreta.MethodsThis prospective observational study, conducted in a large public maternity hospital, included 41 women with an antenatal diagnosis of placenta accreta, of whom 20 underwent cesarean hysterectomy and 15 received autologous blood after cell salvage. Intraoperative cell salvage was used for autologous blood transfusion, and salvaged blood was monitored for prewash and postfiltration squamous cells, fetal hemoglobin, and potassium concentration. Pre- and postoperative hemoglobin, platelet count and coagulation profile were compared.ResultsTwenty women underwent caesarean hysterectomy. Cell-salvaged blood was collected in 18 women and re infused in 15 women (83.3%). The mean volume of reinfused salvaged blood was 1476 ± 247 mL. Mean potassium concentrations (1.4 ± 1.2 versus 3.7 ± 0.42 mEq/L) and median squamous cell counts (0 [0–1] versus 8 [3–12]/high power field) were significantly lower postfiltration compared to prewash values. There were no instances of intraoperative or postoperative amniotic fluid embolism, hypotension, sepsis or coagulopathy. Of the 15 women who received autologous blood, 13 (86.7%) did not require allogeneic red blood cell transfusion.ConclusionsAutologous transfusion of salvaged blood can be used to minimize allogeneic transfusion in women undergoing cesarean hysterectomy for placenta accreta.     

三氧化二砷对小鼠肝脏祖细胞生物学特性的影响

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对小鼠肝脏祖细胞(AHPCs)增殖及代谢的影响.方法 应用改良Seglen二步法原位灌注结合机械离心获取AHPCs,体外培养并持续观察超过40 d.应用免疫荧光技术对AHPC及其形成的克隆进行白蛋白、甲胎蛋白(AFP)和细胞角蛋白19 (CK19)染色.取原代培养12d的细胞随机分为3组:对照组(不含As2O3)、低浓度组(含2μmol/L As2O3)和高浓度组(含4 μmol/L As2 O3).干预48 h后,采用免疫荧光法观察细胞核增殖抗原(Ki-67)阳性细胞所占的比例,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Ki-67基因的表达,Western blot技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中尿素浓度的变化.结果 体外培养的AHPC可持续扩增超过40 d,培养第1天强阳性表达白蛋白,培养第5天细胞克隆开始表达AFP,第35天表达CK19.阴性对照组所含Ki-67阳性细胞的比例较高(25.1±2.8)％,而As2O3(2μmol/L)组[(18.8±1.0)％]和As2O3(4μmol/L)组[(11.8±2.0)％]的Ki-67阳性细胞比例逐渐降低.Ki-67 mRNA的表达量在As2 O3(2μmol/L)组(0.823 ±0.012)明显下降,并以As2O3(4μmol/L)组(0.309 ±0.002)降低最为明显.随着As2O3浓度的增加,PCNA表达逐渐下降,并呈剂量-效应关系.阴性对照组细胞代谢产物尿素浓度较高[(0.586 ±0.056) mmol/L]随着As2O3浓度增加As2O3(2μmol/L)组[(0.506±0.058) mmol/L]与As2O3 (4 μmol/L)组[(0.410±0.045) mmol/L]尿素浓度逐渐下降.结论 成功建立AHPC体外培养模型.As2O3能抑制原代AHPC的增殖,并降低其代谢能力.     

人大隐静脉平滑肌细胞体外培养及其生长特性分析

目的：探讨人血管平滑肌细胞（VSMC）体外培养方法及其生长的特性。 方法：采用组织块贴壁结合酶消化法培养人大隐静脉VSMC并传代,以形态学观察、免疫荧光染色法、考马斯亮蓝染色法鉴定细胞;以台盼蓝染色法、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、绘制生长曲线、划痕法测定细胞成活率、增殖及迁移能力。 结果：原代培养5~7 d细胞从组织块爬出,传代细胞呈“峰-谷”样生长;胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;考马斯亮蓝染色可见VSMC细胞骨架呈致密束状;传代细胞成活率为97%;生长曲线呈类“S”形;细胞生长3~6 d内光密度值变化明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化显著。 结论：体外培养的VSMC纯度高,结构、功能良好,为收缩表型,细胞生长第3~6天增殖活力较强,24 h内迁移能力最强。