儿童呼吸道腺病毒基因分型方法的建立及其应用

目的 利用PCR技术,建立引起儿童呼吸道感染的腺病毒的基因分型方法,便于推广和应用.方法 分析GenBank中不同型别腺病毒的六邻体基因序列特点,设计不同型腺病毒的特异性引物,以PCR方法进行基因分型,建立基因分型方法,并利用此方法对广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒感染进行了基因分型.结果 建立了呼吸道腺病毒的基因分型方法.广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒为3型腺病毒.结论 PCR方法可进行腺病毒的基因分型,且简便、结果可靠,便于推广应用.     

诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建

目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.     

腺病毒载体介导的lacZ基因在NG细胞系及大鼠黑质的表达

本实验用标记基因ｌａｃＺ５型重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ）转染培养的ＮＧ细胞系，Ｘ－ｇａｌ染色检测转染效率．在培养的ＮＧ细胞系，当病毒滴度为２×１０８时，转集率达到５０％，当滴度为２×１０９时，转染率达１００％，有较好的量效关系；固定病毒液度为１０１０，培养２～１６ｈ，细胞的转染率随时间延长而提高，有较好的时效关系。将Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ注射到大鼠黑质部位后，分别于注射后３～１２０ｄ取脑、切片、Ｘ－ｇａｌ染色，发现黑质局部从第７ｄ开始有部分蓝染，第１０ｄ达高峰，注射局部感染率１００％；９０ｄ时开始下降，持续至１２０ｄ；纹状体等其它部位无蓝染．上述结果提示，腺病毒载体介导的标记基因可在培养的神经细胞系和中脑黑质部位高效表达，为进一步开展中枢神经系统退变性疾病尤其是帕金森氏病的基因治疗奠定基础。     

脊柱融合的基因治疗

稳定的脊柱融合与相邻椎骨的融合有关，经典的脊柱融合手术采用剥离椎骨，自体髂骨植骨融合术，虽然应用自体髂骨植骨被认为是植骨融合的金标准，但是它常伴有并发症出现，基因治疗被认为是促进脊柱关节固定融合的新途径，研究表明在动物模型中应用腺病毒，脂质体搭载人骨形成蛋白（hBMP)基因族能促进脊柱融合，有关在动物模型中通过基因转染促进脊柱融合的研究，本文对此作简要介绍，弄清楚骨形成中基因的表达和开发出新的基因转染载体是目前研究的重点，相信在不远的将来，基因治疗脊柱融合能在临床中得到应用。     

腺病毒载体介导bcl-2基因转染在离体和在体状态下对损伤运动神经元的保护作用

本文目的在于观察携带 bcl-2基因的重组腺病毒 (Ad/ s-bcl-2 )在离体和在体条件下对损伤运动神经元的保护作用。采用培养脊髓运动神经元的谷氨酸损伤模型和大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,评价重组 bcl-2腺病毒对损伤运动神经元的影响。指标是bcl-2原位杂交和免疫组化反应、台盼蓝拒染法检测培养神经元存活、TU NEL 阳性神经元计数以及脊髓运动神经元 ACh E反应。结果 :(1) Ad/ s-bcl-2可转染离体和在体脊髓运动神经元并使其过表达 bcl-2。 (2 )过表达 bcl-2可延长培养神经元的生存时间。(3 )过表达 bcl-2可显著地减少谷氨酸诱导的原代培养脊髓运动神经元的凋亡以及坐骨神经切断损伤诱导的脊髓运动神经元的凋亡。 (4 )过表达 bcl-2可显著地缓解坐骨神经损伤诱导的神经元内 ACh E的活性降低 ,并加速其恢复。本研究结果提示 :腺病毒载体中介 bcl-2基因转染对离体和在体损伤的运动神经元均具有保护作用     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒免疫效果的研究

目的了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(Ad5F35-LMP2),免疫恒河猴的特异性细胞和体液免疫的效果。方法分别使用高剂量(1.5×1010TCID50/只)、中剂量(1.5×109TCID50/只)、低剂量(1.5×108TCID50/只)Ad5F35-LMP2重组腺病毒,同时设对照组(PBS4.0ml/只)。肌内注射免疫恒河猴,每个月一次,共免疫3次,第0、4、8、12周时使用Elispot方法检测猴外周血EBV-LMP2细胞毒性T细胞应答,同时应用免疫酶方法检测血清中LMP2抗体。结果3个剂量Ad5F35-LMP2腺病毒免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答,免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系,较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的高。结论Ad5F35-LMP2非复制型重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV-LMP2特异性细胞和体液免疫反应。     

腺病毒编码人TRP2修饰DC诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的研究

目的比较腺病毒载体(Ad)介导人和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-relatedpro-tein2,TRP2)修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DC)诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的差异。方法Ad编码人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)体外感染小鼠BM-DC并体内皮下免疫C57BL/6小鼠,7d后取出被免疫小鼠脾细胞行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤试验(invivoCTL)和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析CTL的杀伤活性和IFN-γ的产生;或给免疫后小鼠皮下接种小鼠B16.F10黑色素瘤细胞,观察荷瘤小鼠的成活情况。结果invivoCTL和ICS分析显示,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠,其6hCTL杀伤率为(98.7±1.2)%,IFN-γ产生的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的(1.25±0.21)%;而AdmTRP2/BM-DC免疫的小鼠,其6hCTL杀伤率和产生IFN-γ的CD8+T细胞比例分别为(28.6±6.3)%和(0.24±0.06)%。荷瘤试验表明,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠后1周皮下接种106B16.F10细胞,观察3个月100%的小鼠无瘤生长;而接种5×104B16.F10细胞至AdmTRP2/BM-DC免疫1周的小鼠,3个月后小鼠成活率仅为40%。结论Ad介导异种(人)TRP2较自身(小鼠)TRP2修饰的BM-DC更为有效地打破肿瘤免疫耐受、诱导强烈的抗黑色素瘤免疫反应,是一种高效的以DC为基础的肿瘤疫苗。     

重组B7—2腺病毒载体的构建及其诱导小鼠抗肝癌免疫的初步研究

探讨重组腺病毒介导的Ｂ７－２基因转染对小鼠肝癌细胞免疫原性的影响。构建Ｂ７－２的重组腺病毒载体，通过重组腺病毒介导，将Ｂ７－２和ｌａｃＺ基因分别转染小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６，并在不同时相检测Ｂ７－２和ｌａｃＺ基因的表达水平，建立小鼠肝癌肿瘤模型，在小鼠体内观察Ｂ７－２基因转染对小鼠肝癌免疫原性的影响。成功地构建了Ｂ７－２的重组腺病毒载体，用Ｂ７－２及ｌａｃＺ重组腺病毒分别转染小鼠肝癌细胞，转染后     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E.coli JM109，获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA，转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15 PFU／L；该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响

目的探讨负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响。方法将CTLA4Ig重组腺病毒与Wistar大鼠未成熟树突状细胞于37℃共孵育6h后,经尾静脉注射该大鼠作实验组,另外分别设立Wistar大鼠未成熟树突状细胞、CTLA4Ig重组腺病毒、生理盐水经尾静脉注射为对照。1周后,用0.3%戊巴比妥麻醉各组大鼠后抽血检测CTLA4Ig。取脾脏,经流式细胞术分选出Th1、Th2细胞及CD4 T细胞,行混合淋巴细胞培养检测Th细胞的增殖。用免疫组织化学法检测Th1、Th2细胞的比例。结果实验组血清CTLA4Ig水平(0.654±0.13)显著高于CTLA4Ig重组腺病毒组(0.392±0.10,P<0.01),树突状细胞组及生理盐水组未检出。实验组Th1细胞的增殖指数(742±161)、Th1/Th2(0.16±0.05)均显著低于各对照组(分别与未成熟树突状细胞组、CTLA4Ig重组腺病毒组、生理盐水组相比,P均<0.01);而Th2细胞的增殖指数(9162±598)显著高于各对照组(P均<0.01)。结论负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞可显著抑制大鼠Th1细胞增殖,促进Th2细胞增殖,使Th细胞由Th1向Th2显著偏移,诱导有效的免疫耐受。