链霉菌RNA聚合酶的异质性和启动子的多样性

链霉菌是革兰阳性好氧土壤细菌,其生活周期涉及到一个复杂的形态分化过程,包括孢子发芽、营养菌丝生成、气生菌丝形成和孢子生长.链霉菌的基因组大约为8×10~6~1×10~7个碱基对,相当于大肠杆菌的2倍多,其DNA含有异常高的GC比(约为73%),并有证据表明,染色体的线性形式在链霉菌中很普遍.在链霉菌中,从形态分化到次级代谢过程无不为一个复杂的、常常是相互偶联的多层次调控系统所支配.这些调控层次包括:启动子和RNA鄹合酶的多样性,阻遏作用,活化作用,感受器/响应器调控系统,ppGpp系统,调控tRNA系统,以及被誉为细菌激素的丁羧内酯类化合物系统.许多异源基因,包括人的白细胞介素2(IL-2),牛的生长激素,大肠杆菌木糖异构酶基因等,都可在链霉菌中获得表达.高活性启动子的存在往往是外源基因表达的关键.因而,了解有关链霉菌启动子结构与基因表达的关系,对于构建链霉菌分泌表达载体相当重要.     

血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞

OBJECTIVE: To observe the selective killing effect of adenovirus (Ad)-mediated double suicide gene driven by kinase domain-containing receptor(KDR) promoter on human colorectal cancer LoVo cells and human umbilical vein endothelial ECV304 cells. METHODS: The plasmid pAdEasy-KDR-CDglyTK was transfected into 293 packaging cells for amplification of the infectious Ad and used to infect the KDR-producing cells (ECV304 and LoVo) and the KDR-nonproducing cells (LS174T) respectively. The three cells were treated with the prodrugs 5-flurocytosine (5-FC) and ganciclovir (GCV) at different concentrations after infection. The killing effects of the fusion gene system on the cells were evaluated. The distribution of cell cycle was detected by flow cytometry. RESULTS: The infection rates of the recombinant Ad were similar among the 3 cells, gradually increasing with the increment of multiplicity of infection (MOI) and reaching 100% with the MOI of 200. The LoVo cells and ECV304 cells infected with Ad-KDR-CDglyTK were highly sensitive to both of the prodrugs (P>0.1), whereas the infected LS174T cells failed to exhibit similar sensitivity (P<0.001). The killing effect of CD/TK fusion gene on the target cells was much stronger than that of either suicide gene (P<0.001). The cell cycle of LoVo cells was arrested at G1 phase. CONCLUSION: The CD/TK fusion gene system driven by KDR promoter can selectively kill KDR-expressing human colorectal cancer LoVo cells and endothelial cells.     

利用T7和PR双启动子的新型表达载体的构建及其应用

构建具有λＰＲ与Ｔ７双启动动子的新型原核表达载体ｐＤＯＧ，以便使用同一载体研究不同诱导条件下，重组蛋白在大肠杆菌中表达，降解以及折叠的情况，从而选择最佳的诱导条件。方法采用ｐＢＶ２２０与ＰＥＴ－３表达载体作为原始材料，将ＰＥＴ－３上包括Ｔ７启动子与Ｔ７ｇ－１０释译起始序列的一段序列克隆到     

谷胱甘肽S-转移酶P1启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌顺铂耐药细胞的体内杀伤作用

卵巢癌是恶性程度最高的妇科肿瘤之一，化疗药物顺铂作为卵巢肿瘤治疗的一线药物，价格低廉，疗效较好。但是，对顺铂存在耐药是卵巢癌治疗中的主要障碍，对晚期患者即使给予标准化化疗，也不能明显延长其生存时间，5年生存率低于30％。谷胱甘肽S-转移酶(glutathion Stransferases，GSTs)是一个多功能同工酶家族，与多种细胞内毒性复合物的毒性解除作用有关。在卵巢肿瘤细胞株的     

直肠癌中m7G调控因子构建的修饰模式探索

目的 构建基于N7-甲基鸟嘌呤(N7-methylguanosine,m7G)相关基因的直肠癌(rectal cancer,RC)预后预测模型。方法 本研究从TCGA和GEO数据库中收集了292例直肠癌患者资料,综合分析了26个m7G调控因子的表达水平、突变情况及与患者预后的关系。笔者定义了两种m7G修饰模式并使用主成分分析(PCA)构建了m7G评分系统。结果 与邻近正常组织比较,m7G调节因子在直肠癌中普遍存在差异表达,并且多数与患者预后相关。笔者进一步在RC样本中确定了两种不同的m7G修饰模式,发现不同m7G分型之间存在临床特征和总生存期差异,并且证明m7G评分系统可以判断患者的预后。结论m7G 甲基化修饰异常与直肠癌的发生密切相关,对大量直肠癌样本中不同m7G模式的分析增进了对肿瘤调控网络的理解,m7G评分系统的构建可以为患者的预后评估和个性化治疗策略提供新的思路。     

佛波酯对人胃癌细胞Ha-ras基因启动子及启动子结合蛋白的影响

目的探讨佛波酯（PMA）对人胃癌细胞BGC-823 Ha—ras基因启动子活性及启动子结合蛋白活性的影响。方法通过RT-PCR和运用自行构建的真核表达载体prasEYFP转染细胞进行荧光细胞检测，并应用凝胶电泳移动检测、Southwestern blotting等方法检测PMA（100μg／L）处理BGC-823细胞72和96h后，对Ha—ras基因表达水平、Ha—ras基因启动子活性以及对Ha—ras启动子结合蛋白的影响。结果经PMA（100μg／L）处理72和96h，与未处理细胞相比，BGC-823细胞中Ha—ras基因表达显著降低，Ha—ras基因启动子活性分别被抑制65．2％和71．8％；同时两个Ha-ras启动子结合蛋白活性也显著降低，经检测，其分子量分别约为18kD，35kD。结论PMA长期处理通过降低人胃癌细胞中Ha—ras启动子结合蛋白活性使Ha—ras启动子活性被抑制，从而在转录水平上调节Ha—ras基因表达。     

肿瘤细胞中的表观遗传编码紊乱

不改变基因的DNA编码,通过改变DNA双链与组蛋白间紧密度来决定基因是否转录表达,这称为表观遗传编码机制。表观遗传编码的生理作用是通过组蛋白修饰和DNA甲基化,调控细胞在适当的时间、空间位置表达适当的基因,从而控制细胞的增殖状况和分化方向。在细胞发育过程中,细胞内DNA甲基化水平增龄性增高,基因转录活性逐渐降低,使细胞从幼稚增殖进入成熟分化。肿瘤细胞中出现表观遗传编码紊乱,致细胞增殖失控,不能进入分化成熟阶段。基因启动子出现甲基化重排,阻碍转录因子与启动子结合,导致基因转录丧失正常调控,合成成熟功能蛋白受阻。利用表观遗传机制(如,RNA干涉)可成为肿瘤治疗的新方法。     

C基因型乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子突变与疾病进展的相关性研究

目的探讨HBV前C区（PreC）及基本核心启动子（BCP）突变与慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者疾病进展的关系。方法收集88例慢性HBV感染者血清标本，包括36例无症状携带者（其中24例为HBV携带者，12例为HBsAg携带者）、36例慢性乙型肝炎（慢性乙肝）和16例肝硬化患者。所有标本均经型特异性引物PCR法鉴定为HBVC基因型，并用巢氏PCR法扩增HBVPreC和BCP基因片段，用PCR产物直接测序法测序，然后用ClustalW1．8软件进行序列分析。结果在50例HBeAg阳性患者中，无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762／A1764双突变率和T1846突变率分别为12．5％、42．1％、100％和0％、5．3％、28．6％，差异均有统计学意义（P值分别为0．03和0．02）。在38例HBeAg阴性HBV感染者中，无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762／A1764双突变率分别为16．7％、58．8％和66．7％，差异无统计学意义（P=0．08）。肝硬化组的C／G1753突变率显著高于无症状携带者及慢性乙肝组（分别为55．6％、8．3％、11．8％，P=0．01），其A1896突变率也高于无症状携带者组（分别为55．6％、8．3％，P=0．01）。结论HBVT1762／A1764双突变与C基因型HBV慢性感染者的疾病进展有关。     

乳腺癌发生模型MCF10各阶段细胞系中TIMP3基因启动子区甲基化分析

目的探讨抑癌基因TIMP3失活与乳腺癌发生和进展的关系。方法用甲基化特异性PCR技术和亚硫酸盐测序技术检测乳腺癌发生模型MCF10的增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系MCF10CA1a和转移癌细胞系MCF10CA1d、MCF10CA1h中TIMP3启动子区甲基化状态。结果甲基化特异性PCR分析显示,在上述各细胞系中,TIMP3启动子区均呈高度甲基化状态。亚硫酸盐测序显示,在上述各细胞系中,测序区内的68个CG位点几乎全部发生了甲基化,且甲基化累及了绝大部分等位基因。结论TIMP3基因启动子区甲基化在乳腺癌的发生和进展中起重要作用,可能成为早期诊断乳腺癌和判断乳腺癌预后的分子生物学标记。