逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测IL—6mRNA

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录－聚合酶链反应－微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL－6mRNA的方法。方法：从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA，进行RT－PCR扩增，PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交，用链亲和素－辣根过氧化物酶（SAV－HRP）及底物系统检测杂交信号。结果：该方法检测IL－6mRNA的灵敏度明显高于逆转录－聚合酶链反应－琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT－PCR和酶联夹心杂交均无非特异性阳性信号出现；重复性良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于细胞因子mRNA的定量检测。     

超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究

目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌“分子搭桥”的新途径。方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165mRNA表达,蛋白印迹杂交(WesternBlot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果。结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径<5μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组。结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应。     

端粒酶活性与膀胱癌T24细胞生长

目的 :研究端粒酶逆转录酶基因 (h TERT)反义寡核苷酸 (ASODN)对膀胱癌 T2 4细胞生长的影响。方法 :用脂质体介导技术 ,将 h TERT基因 ASODN转染入膀胱癌 T2 4细胞中应用端粒酶 PCR- EL ISA法检测端粒酶活性变化 ,MTT法测定细胞生长变化 ,并用流式细胞术观察其对 T2 4细胞周期的影响。结果 :h TERT基因 ASODN能显著地抑膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性 ,癌细胞生长增殖受限 ,同时抑制具有序列特异性和剂量依赖性 ,并出现细胞凋亡现象 ,其凋亡率 (15 .8% )明显高于 SODN转染组 (0 )和空白对照组 (1.9% ,P<0 .0 5 )。结论 :h TERT基因 ASODN能特异性抑制膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性和生长 ,促进其细胞凋亡。     

前列腺特异膜抗原mRNA检测方法的建立及应用

目的 建立前列腺特异膜抗原(PSM)mRNA检测方法。方法 利用异硫氰酸胍／酚／氯仿／异戊醇一步法从前列腺癌患者外周血有核细胞或前列腺癌组织中提取总RNA,进行RT-PCR扩增。结果 在PCR反应体系中投入相当于1．100个癌细胞所含总RNA量时,均能得到清晰的262bp的产物带。结论 本法有很高的稳定性和灵敏度。临床应用有助于早期发现前列腺癌转移、复发和判断疗效。     

转化生长因子—β1影响瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3和Smad7 mRNA表达的调控机制

目的 研究转化生长因子—β1(TGF—β1)影响瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3，7mRNA表达的调控机制。方法 用放线菌酮(CHX)种放线菌素D预处理KFB，以分别阻断KFB内源性蛋白质的合成及mRNA合成。采用逆转录PCR法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3，7mRNA表达水平。结果 经CHX预处理后，KFB的Smad3 mRNA表达轻度上调，并完全抑制了TGF—β1对KFB Smad3 mRNA的下调作用，而CHX预处理对KFB的Smad7 mRNA表达及TGF—β1上调Smad7 mRNA的作压并无明显影响。经放线菌素D预处理后，随TGF—β1作用时间延长，KFB的Smad3 mRNA表达水平无明显下降。结论 TGF—β1对KFB Smad3 mRNA表达的调控过程可能还需要细胞合成其他蛋白的参与；但对Smad7 mRNA表达的调控则不需要细胞合成其他蛋白参与，KFB细胞中的Smad7可能也是活化的Smads的直接靶基因。     

IL-6受体α亚单位mRNA和蛋白在人白血病细胞中的表达

为了探讨IL－6R的α亚单位基因与蛋白在人白血病细胞中的表达，为临床利用IL－6／IL－6R系统介导重组IL－6－PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞提供可靠依据，采用RT－PCR半定量技术、直接免疫荧光标记及流式细胞术检测了IL－6R的α亚单位基因及蛋白在多种人白血病细胞细胞系中的表达。结果表明，粒系、单核系、红白血病细胞系HL－60，KG－1，U937和TF－1均高表达IL－6R的α亚单位基因和蛋白；淋巴系白血病细胞系Raji亦有一定量的基因表达；而淋巴系细胞等CEM和HuT28以及慢性粒细胞白血病细胞系K562无论是IL－6Rα亚单位的基因还是蛋白均为阴性。相对表达丰度依次为KG－1＞TF－1＞U266＞U937＞HL－60＞Raji。鉴于粒系、单核系、红白血病细胞高表达IL－6Rα亚单位的基因和蛋白，而IL－6Rα亚单位蛋白在正常人外周血细胞均为阴性表达这一事实，提示可以利用IL－6／IL－6R系统介导重组IL－6－PE40外毒素融合蛋白进行靶向杀伤和治疗这些白血病，而且不会对正常血细胞产生毒副作用。     

应用实时RT-PCR技术的mRNA定量分析

1　ｍＲＮＡ定量的意义特定基因的表达水平可反映细胞的生长、存活状态 ,对特定基因转录水平的定量分析已成为基因功能研究的核心部分[1] 。最近 ,分子生物学技术的飞速发展使得ｍＲＮＡ定量分析用于临床诊断成为现实 ,其应用涉及面很广 ,包括检测肿瘤细胞耐药基因的调节与表达、化疗疗效的分析、基因治疗的生物动力学与转录、表达水平的研究 ;并提供了评价肿瘤进展 ,检测外周血中肿瘤细胞的有效手段 ;此外 ,ＲＮＡ定量分析还可用于病菌、病毒的检测[2～ 6 ] 。通常用于ｍＲＮＡ定量分析的方法有 :①Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交、原位杂交 +后续…     

补肾填精方防治阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆损害的分子机制

目的探讨补肾填精方防治铝致阿尔茨海默病(AD)的分子机制。方法用长期腹腔注射AlCl3复制大鼠动物模型,用RT-PCR检测端脑皮质beta-淀粉样前体蛋白mRNA异构体-APP695mRNA水平,用Y电迷宫仪检测大鼠的学习记忆能力。结果模型组大鼠端脑皮质APP695mRNA的表达水平明显升高(P<0.05),学习记忆能力明显降低(P<0.05)。中药干预后,端脑皮质APP695mRNA表达较模型组明显降低(P<0.01),学习记忆能力明显提高(P<0.05)。结论端脑皮质APP695mRNA表达水平升高与学习记忆能力减低明显相关,通过抑制端脑皮质APP695mRNA的过量表达是补肾填精方防治AD模型大鼠学习记忆能力损害的机制之一。     

内毒素致伤大鼠白介素-10表达及肺组织激活蛋白-1活性的变化

目的：观察内毒素(LPS)致伤大鼠血浆IL－10及肺组织IL－10mRNA含量和激活蛋白－1（AP－1）活性的变化,探讨AP－1对IL－10基因表达的作用。方法：采用LPS（2、4、6和8mg/kg)致伤Wistar大鼠,在各时间点（1、2、4和6小时）制备动脉血浆并取肺组织。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆IL－10含量,采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测IL－10mRNA含量;采用凝胶迁移率分析法（EMSA）检测AP－1活性。结果：①LPS可使血浆IL－10含量及肺组织的IL－10mRNA含量和AP－1活性同步升高;②LPS≥6mg/kg时,血浆IL－10含量及肺组织的IL－10mRNA含量和AP－1活性的高峰增长幅度显著加大。结论：急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征时IL－10基因表达增强与AP－1活性同步升高有关。     

胃良恶性病变组织中IL-8 mRNA、TSP-1 mRNA的表达及意义

目的 研究胃良恶性病变组织中白细胞介素—8(IL-8)mRNA和血小板反应素—l(TSP—1)mRNA表达及其临床病理意义。方法 将52例胃癌和32例胃良性病变标本经10％福尔马林固定后常规制作石蜡包埋切片，采用原位杂交染色法研究其IL—8 mRNA和TSP—l mRNA的表达。结果 胃癌IL-8 mRNA表达阳性率明显高于胃良性病变(61．5％vs6．2％，P＜0．01)；TSP—l mRNA表达阳性率明显低于胃良性病变(50．0％vs90．6％，P＜0．01)，胃腺癌IL-8 mRNA阳性率较明显低于印戒细胞癌，而TSP—l mRNA则相反，但差异均无显著性(均P＞0．05)。组织学分级I级、癌细胞未没润深肌层及无淋巴结转移病例IL-8 mRNA阳性率明显低于组织学分级Ⅲ金、癌细胞浸润深肌层或浆膜层和淋巴结转移病例，且两两比较差异均有显著性(O＜0．05)，但TSP—1 mRNA表达则相反。结论 IL—8 mRNA和TSP—l mRNA可能是反映胃癌生物学行为、转移发生和预后的重要生物学标记物，检测胃良性病变两者的表达在预防和早期发现胃癌方面可能有重要临床意义。