Lipofectamine介导转染神经干细胞的研究

目的观察阳离子脂质体法转染体外培养神经干细胞的转染效率和外源基因的表达。方法从1d龄新生鼠大脑皮层组织培养神经干细胞，带有报告基因GFP的穿梭质粒pAd．Tract-CMV经Lipofectamine介导转染神经干细胞后观察GFP表达，用流式细胞仪测定转染率。并观察阳离子脂质体对神经干细胞的毒性作用。结果荧光显微镜观察到被转染的神经干细胞长期表达绿色荧光蛋白。流式细胞仪结果显示转染率最高可达到39．99％。转染时，阳离子脂质体浓度超过24ml／L时表现出细胞毒性。结论阳离子脂质体hpofectamine介导转染神经干细胞效率较高，外源基因表达时间长。     

反义AKT2 RNA逆转C6胶质瘤的细胞恶性表型

目的研究反义AKT2RNA逆转C6鼠脑胶质瘤细胞恶性表型。方法将逆转录病毒LXSN为载体的反义AKT2构建体脂质体复合物直接转染人脑胶质瘤细胞系TJ905和鼠脑胶质瘤细胞系C6,LXSN载体转染组为空载对照。随机筛选阳性克隆并应用蛋白印记和原位杂交鉴定转染。MTT法和TUNEL法评价细胞的增殖活性和凋亡,Transwell法分析侵袭能力,划痕实验研究细胞迁移能力,流式细胞法分析细胞周期,并进行GFAP的表达分析。结果转染ASAKT2cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制。与C6对照组和LXSN空载组比较,转染反义AKT2后C6细胞存活率均明显下降(P<0.01),凋亡指数增加(0.33vs13.67,P<0.01),侵袭能力和细胞迁移能力抑制,诱导细胞出现G0/G1细胞周期阻滞,上调GFAP的表达。结论反义AKT2RNA基因治疗通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭与迁移并使G0/G1细胞周期阻滞逆转其恶性表型,AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

大鼠肝移植中脂质体介导IL-10基因转染供肝的实验研究

目的观察供肝转染IL-10后基因表达情况.方法应用改良"二袖套法"行Lewis到BN大鼠肝移植11例,然后分为对照组3例; 空载体转染组4例,术中供肝冷保存期门静脉注射Lipofectamine 2000-pCR3.1空载体质粒复合物,保存45 min后行肝移植; 重组IL-10(rIL-10)转染组4例,术中供肝冷保存期门静脉注射Lipofectamine 2000-pCR3.1 rIL-10复合物,保存45 min后行肝移植.术后第6天处死全部大鼠,取血清检测IL-10水平,另取肝组织行免疫组化染色和RT-PCR检测肝细胞IL-10表达水平.结果 rIL-10转染组血清IL-10水平明显升高,肝上下腔静脉IL-10水平可达(639.27±67.11) pg/ml,是肝下下腔静脉IL-10水平的近1.4倍(P=0.024); 免疫组化染色结果示肝细胞胞桨呈棕黄色或深棕色,而其他两组肝细胞着色轻微或不明显.肝组织RT-PCR显示,IL-10 mRNA的表达在rIL-10转染组明显处于高水平(P=0.000).结论脂质体介导,体外冷保存期经门静脉途径进行供肝转染IL-10,可以使IL-10在肝脏获得较高水平的表达.     

自制纳米级超声微泡造影剂与脂质体基因转染效率的比较

目的 以GFP为目的 基因,比较自制纳米级超声微泡造影剂和脂质体的转染效率,探讨自制纳米级超声微泡造影剂作为基因载体的可行性.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测超声微泡浓度对HepG2的细胞毒性;取安全浓度的超声微泡造影剂和脂质体分别与4、8、16μg的PShut-tle-IRES-hrGFP-1质粒结合后转染HepG2细胞,24 h后利用荧光显微镜和流式细胞术检测并比较两者的GFP转染效率.结果 MTT法显示超声微泡造影剂浓度≤5%时对HepG2细胞生长无明显影响(P＜0.05);超声微泡造影剂能将GFP基因成功转运到HepG2细胞内并高效表达,微泡造影剂+8μg质粒组转染效率达(32.61±3.42)%;脂质体+4 μg质粒组的转染效率为(34.12±8.06)%,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 自制纳米级超声微泡造影剂能成功转运外源DNA进入细胞内,其转染效率与脂质体无明显差异.     

庆大霉素脂质体同种异体骨体外抑制金黄色葡萄球菌生物膜的研究

目的 探讨一种新的抗生素缓释系统的制备,为金黄色葡萄球菌生物膜感染的治疗提供新思路. 方法制备庆大霉素阳离子脂质体及兔同种异体骨,并采用低温真空负压吸引法将二者复合,制备成庆大霉素脂质体同种异体骨,并行阳离子脂质体抗生素释放试验.构建金黄色匍萄球菌生物膜模型,于体外探讨由庆大霉素脂质体同种异体骨中释放出的阳离子脂质体庆大霉素对细菌生物膜的抑制作用. 结果成功制备庆大霉素脂质体同种异体骨,可持续释放庆大霉素脂质体达12d,前3 d释放具有爆发效应,所释放的庆大霉素脂质体对金黄色葡萄球菌生物膜生长的抑制作用与新制备的庆大霉素脂质体相似,在低浓度(3.2 mg/L)时二者对金黄色葡萄球菌ATCC 29213生物膜生长的抑制作用均明显强于单独使用庆大霉素(P<0.05). 结论低温真空负压吸引法制备庆大霉素脂质体同种异体骨并不影响所释放的庆大霉素脂质体的抗芮作用,在体外具有高效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的作用,且在低浓度时抑制作用更为明显.     

COX-2反义RNA抑制肝癌细胞增殖的实验研究

目的 研究COX-2反义RNA对肝癌细胞增殖抑制的作用及其机制,探讨肝癌治疗的新途径.方法 人工合成的COX-2反义RNA片段及无关对照空质粒经脂质体包裹后作用CBRH7919细胞.通过MTT法、细胞周期分析、RT-PCR及裸鼠体内接种等方法测定细胞体内外增殖的变化.结果 经COX-2反义RNA处理的CBRH7919细胞与对照组CBRH7919细胞相比,体外增殖速度减慢(细胞增殖抑制率达78%)、DNA合成受抑(S期细胞数为34.8%vs59.9%),细胞周期G_0/G.比例明显提高,裸鼠体内成瘤率下降(25%vs100%).而凋亡相关基因表达并无明显差异(P>0.05).结论 COX-2反义RNA可有效抑制肝癌细胞的体内外生长增殖,可用于实验性肿瘤基因治疗研究.     

辐射促脂质体介导的IGF-1R反义寡核苷酸对胰腺癌细胞抑制的实验研究

用辐射促转染方法，将脂质体(lipfectin)介导的胰岛素样生长因子．1受体反义寡核苷酸(IGF-1 R ASON)导入胰腺癌细胞(PC-3)，以观察体外PC-3细胞的生长抑制及凋亡情况，以及裸鼠移植瘤的体内抗瘤效果，为胰腺癌的基因治疗提供依据。     

透明质酸修饰的尿酸酶多囊脂质体的体外特性及药效学过程

目的 研究透明质酸修饰的尿酸酶(UC)多囊脂质体(uricase in hyaluronic acid-uricase multivesicular liposomes,UHMVLs)的体外特性及其在大鼠体内的药效学.方法 采用复乳法制备UHMVLs并测定包封率及理化特性.取12只健康雄性SD大鼠,模型组采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾建立高尿酸血症大鼠模型(n=3),UHMVLs组(n=3)和UC组(n=3)分别于建模后尾静脉注射UHMVLs和游离UC,并以正常组(n=3)为对照,测定大鼠血清中尿酸水平.结果 UHMVLs的平均包封率为(62.48±3.87)％ (n=3).UHMVLs和UC最适温度均为40℃,最适pH值分别为8.0和8.5.在同一温度(20～70℃)和pH(6.5～9.5)条件下,UHMVLs中UC的活性均高于游离UC(P＜0.05).除1、36、48 h外,其余各时间点UHMVLs降低高尿酸血症大鼠模型血清中尿酸水平的效果均较游离UC更显著(P＜0.05).结论 在相同条件下,UHMVLs不仅能提高UC的活性,还可以增强UC的稳定性;UHMVLs在大鼠体内降低血尿酸水平的能力优于游离UC.     

iRGD靶向声学脂质体在类风湿关节炎诊疗中的作用

目的 制备集治疗与成像为一体的载甲氨喋呤(MTX)和吲哚菁绿(ICG)iRGD靶向载药声学脂质体(iRGD-MTX-ICG-ELIP),观察其靶向性及联合低频超声体外抑制滑膜细胞(MH7A)增殖的效果.方法 采用薄膜水化法和冷冻冻干法制备iRGD-MTX-ICG-ELIP,检测其一般特性及声学响应性,通过细胞摄取实验验证iRGD-MTX-ICG-ELIP的体外靶向结合性能,构建类风湿关节炎小鼠模型,通过靶组织的药物荧光强度验证iRGD-MTX-ICG-ELIP的体内靶向性;CCK8法检测iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声体外抑制MH7A增殖的效果.结果 制备的iRGD-MTX-ICG-ELIP粒径为134.4±17.6 nm,电位为-10.07± 4.28 mv,iRGD-MTX-ICG-ELIP中MTX和ICG的包封率分别为(62.56±0.77)%和(95.13±0.82)%;其联合低频超声控释药物发现,随超声作用强度增加和作用时间的延长,MTX与ICG释放均增多.细胞摄取实验表明血管内皮细胞HUVECs对iRGD-MTX-ICG-ELIP的摄取效率比对MTX-ICG-ELIP摄取效率高1.89倍,差异有统计学意义(P<0.05),活体成像实验显示iRGD-MTX-ICG-ELIP在RA发病关节的荧光强度明显强于非靶向组;CCK8检测结果显示,iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声组的MH7A存活率为(32.49±3.04)%,与未联合超声组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 本研究制备的iRGD-MTX-ICG-ELIP粒径小、均一性好,对HUVECs和RA病变关节组织具有较好的靶向性.较佳的药物包封率和声学响应性增强了iRGD-MTX-ICG-ELIP联合超声抑制MH7A的增殖作用,为后续更精准有效的治疗类风湿关节炎提供前期基础.     

脂质体介导的单纯疱疹胸苷激酶基因在人前列腺癌细胞中的表达

目的：提取并鉴定已构建的EB病毒表达载体pDR2-TK，利用脂质体介导的基因转染技术将pDR2-TK转染人前列腺癌细胞并对单纯疱疹胸苷激酶（HSV－TK）表达状况进行检测。方法：采用DNA大量制备及纯化系统提取pDR2-TK，酶切和DNA测序进行鉴定，采用阳离子脂质体法将pDR2-TK导入激素非依赖性人前列腺癌细胞系PC－3m，逆转录PCR（RT－PCR）法和SABC免疫组化法检测TK mRNA和蛋白的表达。结果：扩增提取的质粒经PstⅠ和EcoR Ⅴ酶切后各获得4个及2个片段，与原基因酶切图谱一致；所提取质粒PCR产物经DNA测序，与NCBI公布的HSV－TK基因序列对照，证实所提取质粒含目的基因序,旨质体法转染PC－3m细胞后，mRNA和蛋白均有HSV－TK的表达，其蛋白表达率约为22％。结论：pDR2-TK质粒含有目的的基因HSV－TK，阳离子脂质体法可将pDR2-TK导入人前列腺癌细胞并获得较高效率的表达。