结核分枝杆菌西安分离株北京家族基因型检测及其耐药相关性研究

目的了解西安市结核分枝杆菌临床分离株的耐药情况及其与北京家族基因型(Beijing Family)的相关性,为有效防治结核病提供依据。方法对临床分离结核分枝杆菌采用绝对浓度法进行药物敏感性检测。间隔寡核苷酸分型(Spoli-gotyping)方法进行北京家族基因型鉴定。结果统计学分析采用χ2检验。结果104株结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物,异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB),全部敏感的菌株为71株(68.3%);耐药菌株33株(31.7%),其中,单耐药菌株12株(11.5%),耐多药菌株21株(20.2%)。结核分枝杆菌对4种一线药物INH、RFP、SM和EMB的耐药率分别为24.04%(25/104)、18.69%(19/104)、16.34%(17/104)和2.88%(3/104)。104株结核分枝杆菌中北京家族基因型(BeijingFamily)占全部菌株的83.7%,非北京家族基因型占16.3%。87株北京家族基因型菌株中耐药菌株28株(32.18%),敏感菌株59株(67.82%),而17株非北京家族基因型菌株中耐药菌株5株(29.41%),敏感菌株为12株(70.59%)。经统计学分析其差异无统计学意义(χ2=0.05,P>0.05)。结论西安市分枝杆菌的耐药情况较为严重。结核分枝杆菌北京家族基因型与耐药性之间无明显相关性。     

福建省畲族人群结核分支杆菌IS6110DNA指纹图谱特征分析

目的分析福建省畲族人群和汉族人群结核病患者分支杆菌DNA指纹特征,探讨畲族人群结核病的分子流行病学特征。方法采用基于IS6110的PCR分型方法,对我省10个畲族乡镇调查点分离的50例畲族人群结核菌株和50例汉族人群结核菌株进行检测,用Gel-Pro analyzer4.0软件和NTSYSpc2.10e软件对DNA指纹图谱进行聚类分析。结果100株结核分支杆菌共分为4个主要类型,其中Ⅰ型(北京基因型)59株占59%,Ⅱ型38株占38%,Ⅲ型2株占2%,IV型为1株占1%。汉族病例菌株指纹为Ⅰ、Ⅱ型,以I型为主,占80%,畲族为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型,以II型为主,占56%;经χ2分析,两族病例菌株指纹的型别分布差异有显著统计学意义(P<0.01)。Ⅱ型菌株耐药率(47.4%,18/38)与Ⅰ型菌株耐药率(20.3%,12/59)差异也有显著统计学意义(P<0.05)。结论畲、汉两族主要基因型不同,汉族人群以北京基因型(Ⅰ型)流行为主,而畲族人群则以非北京基因型(Ⅱ型)为主,该型菌耐药率明显高于Ⅰ型,提示与畲族人群结核病高疫情相关,有待于进一步研究。     

结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗的构建、鉴定和表达及其保护力

目的构建和鉴定结核分枝杆菌(MTB)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-ESAT-6疫苗,研究该疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-ESAT-6;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗。用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达ES-AT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。65只BALB/c雌性小鼠,随机分为5组:A组(SC)、B组(IM)、C组(IN)、D组(Bb)、E组(PBS)。分别于免疫后8周用5×105CFU MTB H37Ra减毒株悬浮于10μL PBS中进行鼻腔粘膜接种感染。攻击感染后6w剖杀各组小鼠8只,计数肝、肺组织荷菌量,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖。结果PCR成功扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6疫苗构建成功。免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-ESAT-6的表达产物在相对分子量(35kDa)处有明显的蛋白表达条带,表达效率为20%,且能被活动性结核病人血清特异识别。鼻腔内接种组的肝、肺组织荷菌量明显低于其他免疫组。疫苗接种组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b明显升高,IgG3和IgE无明显变化;疫苗接种组的脾淋巴细胞明显增殖。结论成功构建了结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗,重组Bb-ESAT-6疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有一定免疫保护作用。     

结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶诱导小鼠细胞和体液免疫应答

目的检测结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法选清洁级BALB/c小鼠60只,随机分为两组,实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK融合蛋白10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2w免疫1次,共免疫3次。末次免疫2w后,分别取小鼠脾脏、血清,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞,MTT法检测淋巴细胞对刺激的应答水平,ELISA检测血清各种细胞因子及抗PEPCK抗体。结果实验组小鼠的脾脏明显大于对照组小鼠的脾脏,且粘连严重,CD4+T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4+/CD8+比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);且淋巴细胞的应答能力明显强于对照组小鼠;实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α明显高于对照组,血清抗体滴度随免疫次数逐步增高。结论结核杆菌PEPCK能够有效的刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,尤以细胞免疫反应为主,是很好的抗结核候选疫苗分子之一。     

5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。     

结核分枝杆菌RpfA融合蛋白的免疫学和生物学特性的初步研究

目的在大肠杆菌中表达并纯化结核分枝杆菌RpfA融合蛋白,并初步研究其免疫学和生物学特性。方法Rp-fA融合蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果。分离小鼠的脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数,ELISA法检测培养液上清IFN-γ,IL-2含量;MTBH37Rv毒株静脉感染免疫小鼠,测定脾脏细菌负荷。将不同浓度的复性RpfA融合蛋白和特异性多抗加入到MTBH37Ra中,测定H37Ra的生长曲线。结果RpfA融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞的增殖指数达到3.57,高于生理盐水对照组的1.27(P<0.05);培养上清中IFN-γ含量为362.99±72.75ng/L,IL-2含量为210.10±20.19ng/L,而生理盐水对照组含量均低于50ng/L(P<0.05)。免疫小鼠脾脏细菌负荷计数为5.57±0.37(log10CFU±S),而生理盐水对照组为6.54±0.22(P<0.05)。RpfA融合蛋白对H37Ra的生长有明显促进作用,而加入特异性多抗后可以抑制RpfA融合蛋白的促生长作用。结论RpfA融合蛋白免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,可能作为基因疫苗的候选组分。RpfA融合蛋白对H37Ra生长有明显的刺激作用,可能作为快速培养检验结核分枝杆菌的添加组分。     

非结核性分枝杆菌性兔角膜炎的研究

目的　探讨非结核性分枝杆菌（NTM）性兔角膜炎的临床表现与不同时期的病理变化。方法48只兔（48只眼）随机分为3组：角膜瓣下NTN感染组（UFI组）、角膜瓣下NTM感染后糖皮质激素使用组（UFIC组）及角膜表面NTM感染组（sI组）。观察角膜基质浸润情况,并于术后5、7、14及21d进行角膜病灶细菌定量培养、组织病理学及免疫组织化学检查。结果兔NTM角膜炎在感染后5d角膜组织反应性水肿;7—14d角膜浅基质层出现多灶性点、片状灰白致密浸润;21d角膜新生血管大量增生,白斑形成。术后5、7、14及21d,3组模型角膜基质浸润面积比较差异有统计学意义（F=19．224,P〈0．05）;组间比较,UFIC组角膜浸润面积大于UFI组与SI组,差异均有统计学意义（F=9．362,8．341;均P〈0．05）。角膜细菌定量培养,UFIC组细菌数量高于UFI组与SI组,3组间比较差异均有统计学意义（F=411．272,P〈0．05）。病理学观察,感染后5d角膜基质层大量中性粒细胞浸润,7～14d角膜淋巴细胞灶性浸润,21d角膜成纤维细胞和新生血管增生明显。3组模型于术后5、7、14及21d角膜组织中CD4’细胞计数差异均有统计学意义（F=21．907,196．521,12．552,11．100;均P〈0．01）,CD8^＋细胞计数在感染后7、14d差异均有统计学意义（E=171．115,77．017;均P〈0．01）。结论角膜基质多灶性点、片状灰白致密浸润为NTN性角膜炎临床特征,CD4^＋细胞介导的细胞免疫反应在本感染中起重要作用。（中华跟科杂志,2007,43：613-617）     

脓肿分枝杆菌肺病47例临床分析

目的　提高对脓肿分枝杆菌肺病临床表现的认识。方法 对1998年1月—2001年12月收治的脓肿分枝杆菌肺病47例临床资料进行回顾分析。结果 无合并结核分枝杆菌肺病32例(68.1%),合并结核分枝杆菌肺病15例(31.9%)。有反复抗结核病治疗史31例(66%)。主要症状为咳嗽、咳痰、咯血(痰)。X线胸片中,病灶在3个肺野以上37例(78.7%);两侧受累者28例(59.6%),右侧15例(31.9%),左侧4例(8.5%),病灶内有空洞23例(48.9%),其中右上空洞16例(69.6%),左上空洞9例(39.1%)。对H、R、S、E、Th1321、D、L耐药率高,对A、C、V、CTM耐药率相对低。结论 脓肿分枝杆菌肺病病程长,症状无特异,耐药率高,抗结核治疗疗效差。     

Spondylitis following bloodstream dissemination of Mycobacterium chelonae disseminated in an immunocompetent patient: a case report and literature review

Non-tuberculous mycobacterial spondylitis is a rare spinal infection, especially among patients without acquired immunodeficiency syndrome or other immune impairments. Because of its rarity and non-specific clinical manifestations, diagnosis is often delayed or missed. Here, we present a case of Mycobacterium chelonae spondylitis in an immunocompetent patient and review the relevant literature.     

结核分枝杆菌L型的垂直感染及其对子代小鼠的影响

目的　研究结核分枝杆菌L型的垂直感染及其对子代小鼠的影响。方法　将C5 7BL/ 6N小鼠 (雌∶雄 3∶2 )随机分成 4组 ,分别用自肺癌患者血中分离的结核分枝杆菌L型 (B组 ) ,牛型分枝杆菌 (A组 )及其L型 (C组 )经尾静脉进行感染 ,并用生理盐水注射组作为对照 ,观察感染鼠子代新生鼠和子代成年鼠的病理学改变 ,同时采用培养法、IK抗酸染色和免疫组织化学技术检查组织内的抗酸杆菌及其L型。结果　感染鼠的肺、肝、肾、脑、心等主要脏器组织均发生间质性炎症 ,并有多只小鼠伴有肝脏和卵巢的瘤样增生。新生子鼠中 ,A和B组有间质性炎症表现 ,B组有一例肝瘤样增生 ,C组有一例畸胎 ,组织内有多种形态的分枝杆菌L型 ;成年子鼠中A组有两只良性畸胎瘤。结论　血源性结核分枝杆菌L型和牛型分枝杆菌L型仍有一定的致病性并可能诱导肿瘤发生。通过垂直感染 ,结核分枝杆菌L型可导致子代小鼠的病变。