鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

北京分离株金黄色葡萄球菌基因型分析

目的对2000-2005年北京分离株金黄色葡萄球菌进行基因分型研究,了解其型别构成特征。方法分别对48株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S．aureus,MRSA）和3株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive S．aureus,MSSA）进行spa基因序列分析及脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）分析,并与多位点序列分析（multi locus sequencing typing,MLST）进行比较。结果在MRSA中,t030和t037为主要spa型别,分别占47．92％（23／48）和37．50％（18／48）;t002只在2005年菌株中出现,占14．58％（7／48）。3株MSSA型别分别为t377和t304。PFGE按带型差异及相似度分析,将所有菌株分为5组11型。结论t030和t037是MRSA临床分离株中的spa优势型别,A组和D组为PFGE优势型别。合理使用MLST、PFGE和spa分型方法对我国MRSA防治具有重要意义。     

广东梅州市莱姆病自然疫源地调查

目的了解广东梅州市大埔、平远和梅县莱姆病人群血清流行病学、动物宿主和传播媒介特征。方法应用间接免疫荧光试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）进行人群和宿主动物的血清学检测、个案调查、动物宿主和传播媒介病原学调查。结果检测人群血清2 184份,莱姆病感染率为10.30%（225/2184）,其中林区为10.33%（123/1191）,非林区为10.27%（102/993）,差异无统计学意义（χ^2=0.21,P〉0.5）;检测牛和野鼠血清各30份,感染率分别为23.33%和43.33%;从褐家鼠和白腹巨鼠各分离到1株莱姆病螺旋体;调查蜱506只,其中台湾角血蜱493只,占97.43%,该蜱中肠带莱姆病螺旋体率为16.00%（8/50）,且分离到1株莱姆病螺旋体。结论梅州市存在莱姆病自然疫源地,人群普遍易感,野鼠和牛是该地莱姆病螺旋体的主要动物宿主,台湾角血蜱是主要传播媒介。     

云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染调查

目的 了解云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体自然感染情况。方法 应用单纯随机抽样法,从665份野外鼠形动物肝脾标本中抽取407份,采用巢式PCR对样本进行嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因检测,并对扩增产物测序,应用生物软件MEGA7.0将所测序列与GenBank注册的其它无形体属种株进行序列对比分析。结果 检测野外鼠形动物3目5科12属17种407只,阳性率为3.19%(13/407),其中大足鼠、黄胸鼠和斯氏家鼠阳性率分别为21.43%(3/14)、6.00%(6/100)和4.94%(4/81),其它鼠形动物均未检测出阳性;不同海拔梯度(P=0.219)、不同性别(χ²=0.441,P=0.506)及不同生境间(χ²=0.386,P=0.534)鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率差异无统计学意义;不同季节野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率差异具有统计学意义(P=0.044);序列对比分析显示所有样本基因序列与GenBank中收录的国内外部分嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因序列同源性达100%,进化分析显示与国内外部分嗜吞噬细胞无形体处同一个分支。结论 云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物存在嗜吞噬细胞无形体低度感染。     

四种单增李斯特菌常用核酸检测方法的评价与应用

目的 应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法 比较文献报道的以单增李斯特菌特异性基因lmo0733作为靶标的4种核酸检测方法,评价这4种方法在特异性、灵敏度、检出速率方面的差异,并应用于单增李斯特菌模拟样本和猪肉样本中单增李斯特菌的检测。结果 传统PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法都能准确检测单增李斯特菌,其中MCDA方法检测下限为10 fg/反应,且能在30 min内完成对样本核酸的检测,灵敏度和检出速率优于其它3种核酸诊断方法;MCDA方法对于模拟样本和实际样本的检测效率优于其它3种核酸检测方法和传统分离培养方法,能够提高样本检测的阳性率。结论 MCDA方法作为一种特异、灵敏和高效的核酸检测方法,可用于肉制品中单增李斯特菌检测时的快速筛查,并能提高传统分离培养方法对标本中单增李斯特菌的阳性检出率。     

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的 建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法 通过对10³ CFU/m~10⁶ CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果 空肠弯曲菌在10³ CFU/mL~10⁶ CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5 μg/mL,5 μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论 EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。     

基于颜色判定的环介导等温扩增检测生殖支原体的研究北大核心CSCD

目的建立一种基于颜色判定的快速、灵敏、简便的检测生殖支原体(MG)感染的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法使用PrimerExplorer V5软件依据gap基因保守区域设计4条特异性MG等温扩增引物,通过优化体系dNTPs、MgSO4浓度,建立一种基于羟基萘酚蓝(HNB)作为结果判读指示剂的MG等温扩增方法,进行灵敏度、特异性检测并与普通PCR比较;对30份性病门诊病例标本进行LAMP、RT-PCR和普通PCR检测,并进行比较分析。结果建立的LAMP方法对8种常见支原体以及8种泌尿生殖道常见病原菌扩增均为阴性,特异性度为100%。对于MG ATCC 33530标准菌株核酸的检测限约为10~2copies,与MG普通PCR一致,比MGRT-PCR检测限(10 copies)低一个数量级。30份临床标本使用LAMP、普通PCR和RT-PCR方法的MG阳性检出率分别为16.7%,16.7%和20.0%。结论建立的MG LAMP检测方法灵敏、特异且操作简便,可在基层推广应用。     

大肠埃希菌(EHEC/EPEC)紧密黏附素基因的分型分析

目的 了解大肠埃希菌分离株eaeA基因的多态性。 方法 对不同来源的60株大肠埃希菌分离株的eaeA基因进行聚合酶链反应扩增后直接测序,测序结果在NCBI中进行BLASTn比对,根据比对相似性判定eaeA基因的型别。将获得型别的序列与GenBank中肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)和肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)代表性菌株型别的序列用Neighbor-joining法构建系统发生树,分析其进化关系。 结果 所有EHEC分离株的eaeA基因均为γ型,且序列完全一致。EPEC分离株的eaeA基因型以β1型为主,同时存在ε, κ, ι2, θ型。 结论 EHEC分离株的eaeA基因相对保守,型别单一,而EPEC分离株的eaeA基因表现出较大的多态性。     

模拟粪便标本中的单增李斯特菌的分离和检测

目的 建立针对粪便标本中单增李斯特菌的分离鉴定方法,评价方法的检测下限,以提高感染人群标本中单增李斯特菌的检出率,了解我国人群中该菌的携带及感染情况。 方法 对模拟人粪便标本进行二次增菌,采用Real-time PCR检测,并同时分离培养获得该病原菌。 结果 当每克模拟粪便标本中含有7 cfu的单增李斯特菌时,经过增菌后的标本用Real-time PCR方法可检测出阳性结果,并能够通过单增李斯特菌的选择培养基分离得到病原菌。 结论 本研究为从粪便标本中分离单增李斯特菌和由单增李斯特菌引起的食物中毒事件的病原学调查提供了技术支持,有利于对我国人群中单增李斯特菌的携带或感染状况进行调查分析。     

60株克罗诺杆菌的药敏分析

目的 研究国内分离于11个省(直辖市)婴幼儿配方奶粉或米粉等食品标本中的60株克罗诺杆菌的药物敏感性和耐药性。 方法 采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定菌株对7类14种抗生素的药敏情况。 结果 菌株对头孢吡肟、亚胺培南、美罗陪南平、环丙沙星、复方新诺明5种抗生素的敏感率较高,达到93.5%。但有4株菌对14种抗生素全部耐药,4株菌对头孢呋辛耐药,1株菌对阿莫西林/克拉维酸耐药。 结论 60株克罗诺杆菌中,56株菌对目前医院内治疗肠杆菌科感染的多数抗生素药物敏感;4株菌具有强耐药性,其耐药机制需要今后进一步研究证实。