苦参碱对兔耳增生性瘢痕治疗作用的组织形态学研究

目的:研究苦参碱（matrine,Mat）对兔耳增生性瘢痕治疗作用。方法:利用兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,采用组织形态学的方法对比研究苦参碱在兔耳增生性瘢痕形成过程中的影响。结果:兔耳腹侧面增生性瘢痕局部注射苦参碱后,按时间段取材;VG和HE染色显示真皮层明显变薄,成纤维细胞数量明显减少,胶原排列趋于一致;12周后,对照组苦参碱组的增生指数、成纤维细胞数密度、胶原密度分别为3.25±0.89/2.15±0.12,4517.5±879.6/3551.2±234.1,39.89±14.12/28.75±10.87。结论:苦参碱能抑制兔耳增生性瘢痕的增殖过程,使瘢痕组织纤维化程度明显减轻。     

聚羟基丁酸已酯-聚乳酸材料改性应用于组织工程隆鼻充填材料的可行性

目的:观察以改性聚羟基丁酸已酯即聚羟基丁酸已酯与聚乳酸共混的组织工程软骨做为隆鼻充填材料的可行性。方法:实验于2005-07/11在解放军第四军医大学附属西京医院整形外科实验室完成。①取兔耳软骨细胞的分离、培养并鉴定。②预先将聚羟基丁酸已酯-聚乳酸制备成1.5cm×1.0cm的瓦状形态膜片,表面以聚羟基丁酸已酯-聚乳酸制成的纺丝反复缠绕,形成“三明治”样结构,进行预处理。③进行细胞-支架复合物的体外构建及培养,收集体外扩增的第3代软骨细胞,接种于聚羟基丁酸已酯-聚乳酸支架上。④取3周龄新西兰兔12只,采用随机数字法将其分成实验组和对照组,每组各6只。实验组:将细胞-支架复合物置于兔的鼻背部骨膜下,观察软骨形成情况;对照组:单纯以未接种软骨细胞的支架移植于兔背部皮下。于相同时间点进行检测。结果:经过大体、组织染色及扫描电镜检查发现:①实验组:植入4周后该复合物在兔鼻背下支架表层有软骨层形成,并可见软骨细胞突入至支架材料内部;8周后支架材料继续降解,软骨细胞及细胞基质生成明显,伴有胶原长入。②对照组:植入4周、8周支架材料外周先形成一层透明组织薄膜,周围无炎性细胞浸润,内部为聚羟基丁酸已酯-聚乳酸支架材料,随着时间延续,周围纤维组织增生,支架材料出现不同程度的降解,不能维持原有的空间结构,较实验组结构崩解明显。未见有类软骨样组织形成。结论:以改性聚羟基丁酸已酯(聚羟基丁酸已酯-聚乳酸共混物)做为支架材料构建的组织工程软骨,可用于隆鼻的充填材料。     

蛋白激酶A在干扰素-γ抑制创面愈合和瘢痕形成中的作用

目的:观察干扰素γ(IFN-γ)用于兔耳伤口肉芽组织和瘢痕组织后蛋白激酶A(ProtinaseA,PKA)活性变化及对伤口愈合和瘢痕形成影响,探讨PKA的信号转导作用。方法:用32P掺入法测定使用IFN-γ前后兔耳伤后3,6,11～16d(上皮化时),以及上皮后14,30,45和60d组织的PKA活性,观察伤口愈合时间和瘢痕变化。结果:上皮化时肉芽组织和伤口周边组织的PKA活性高于正常皮肤犤(1.5±0.6)pmol/min·mg,t=3.76,P<0.001和(1.4±0.5)pmol/min·mg,t=2.96,P<0.01犦。IFN-γ延迟创面愈合约1.5d(t=2.64,P=0.01),同时进一步活化PKA:肉芽组织在伤后6d和上皮化时犤(1.6±0.6)pmol/min·mg,t=2.59,P<0.05和(1.8±0.7)pmol/min·mg,t=2.92,P<0.01犦和周边组织上皮化时犤(1.7±0.6)pmol/min·mg,t=2.42,P<0.05犦高于对照。增生性瘢痕组织的PKA活性仅在上皮化时升高犤(1.5±0.5)pmol/min·mg,t=2.26,P<0.05犦,非增生性瘢痕组织的PKA活性在上皮化时犤(1.4±0.5)pmol/min·mg,t=2.08,P<0.05犦和上皮化后14d犤(1.4±0.5)pmol/min·mg,t=2.08,P<0.05犦时较高;IFN-γ进一步升高上皮化时IFN-γ1组:犤(1.8±0.7)pmol/min·mg,t=2.92,P<0.01犦和伤后14d时非增生性瘢痕组织的PKA活性犤IFN-γ1组:(1.79±0.6)pmol/min·mg,t=2.59,P<0.05和IFN-γ2组:(     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,使其分泌血管内皮细胞生长因子,观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。方法:实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后,将培养14d细胞融合约80%的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染,细胞随机分为3组,每组10孔,分别为PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的敏感性。结果:①PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示:小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物,对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果:小鼠NIH3T3细胞转染14d后,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346±23,0,0ng/L(P<0.05)。④四甲基偶氮唑盐法检测结果:PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性(依次为0.96±0.11,0.91±0.10,0.98±0.16,P>0.05)。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。结论:小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞,用于基因治疗。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，使其分泌血管内皮细胞生长因子，观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。 方法：实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后，将培养14d细胞融合约80％的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染，细胞随机分为3组，每组10孔，分别为PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组．空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的敏感性。 结果：①PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示：小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物，对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果：小鼠NIH3T3细胞转染14d后，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346&;#177;23，0，0ng／L（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测结果：PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性（依次为0．96&;#177;0.11，0．91&;#177;0．10，0．98&;#177;0．16，P〉0．05）。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。 结论：小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞，用于基因治疗。     

管状骨髓腔内骨整合式纯钛种植体与骨组织界面的整合状态

目的:自行设计管状骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋状种植体组件,通过动物实验,观察种植体-骨组织界面的骨整合情况,为临床指缺损患者种植体式手指赝复体修复提供材料及依据。方法:实验于2005-08/12在第四军医大学西京医院整形外科实验室完成。采用国产纯钛制做螺旋形柱状种植体,根据成人正常掌骨和近节指骨及其髓腔的解剖学特点及临床应用的可行性,借鉴Bmnemark螺旋型种植体,自行开发研制纯钛种植体。选择新西兰大白兔10只,在麻醉显效后,胫骨髓腔内种植纯钛螺旋状种植体10枚,分别于术后2,4,8,12,16周各处死2只动物取材,X线摄片观察骨结合形成情况。结果:所有实验动物均进入结果分析,种植体无脱落。制备出掌指骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋型种植体组件及配件。①X线观察结果:术后2周时,种植体与骨组织间可见到较明显透光间隙,种植体-骨界面未见骨小梁及新骨形成,术后4～6周,种植体与骨组织间透光间隙减小,可见种植体周围骨密度增高,种植体螺纹间新骨形成明显,术后8周,种植体与骨组织间已无明显透光间隙,均被高密度区替代,种植体周围骨密度增高,种植体螺纹间新骨形成明显,形成更完善的骨界面,界面骨成熟,术后12周与8周相比,变化不大。②大体及光镜观察结果:术后2周时,种植体与骨组织间为软组织界面,未见新骨生成;术后4～6周,种植体周围大量新生骨样组织形成;种植体周围及螺纹间新骨形成明显,形成骨性界面;术后12周与8周相比,骨性界面进一步形成。结论:该掌指骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋状种植体组件,术后8周可以与周围骨组织形成完全骨结合。     

蛋白激酶A在干扰素-γ抑制创面愈合和瘢痕形成中的作用

目的：观察干扰素γ(IFN-γ)用于兔耳伤口肉芽组织和瘢痕组织后蛋白激酶A(ProtinaseA，PKA)活性变化及对伤口愈合和瘢痕形成影响，探讨PKA的信号转导作用。方法：用^32P掺入法测定使用IFN-γ前后兔耳伤后3，6，11～16d(上皮化时)，以及上皮后14，30，45和60d组织的PKA活性，观察伤口愈合时间和瘢痕变化。结果：上皮化时肉芽组织和伤口周边组织的PKA活性高于正常皮肤[(1．5&;#177;0．6)pmol／min&;#183;mg，t=3．76，P&;lt;0．001和(1．4&;#177;0．5)pmol／min&;#183;mg，t=2．96，P&;lt;0．01]。IFN-γ延迟创面愈合约1．5d(t=2．64，P=0．01)，同时进一步活化PKA：肉芽组织在伤后6d和上皮化时[(1．6&;#177;0．6)pmol／min&;#183;mg，t=2．59，P&;lt;0．05和(1．8&;#177;0．7)pmol／min&;#183;mg，t=2．92，P&;lt;0．01]和周边组织上皮化时[(1．7&;#177;0．6)pmol／min&;#183;mg，t=2．42，P&;lt;0．05]高于对照。增生性瘢痕组织的PKA活性仅在上皮化时升高[(1．5&;#177;0．5)pmol／min&;#183;mg．t=2．26，P&;lt;0．05]，非增生性瘢痕组织的PKA活性在上皮化时[(1．4&;#177;0．5)pmol／min&;#183;mg，t=2．08，P&;lt;0．05]和上皮化后14d[(1．4&;#177;0．5)pmol／min&;#183;mg，t=2．08，P&;lt;0．05]时较高；IFN-γ进一步升高上皮化时IFN-γ1组：[(1．8&;#177;0．7)pmol／min&;#183;mg，t=2．92，P&;lt;0．01]和伤后14d时非增生性瘢痕组织的PKA活性[IFN-γ1组：(1．79&;#177;0．6)pmol／min&;#183;mg，t=2．59，P&;lt;0．05和IFN-γ2组：(1．8&;#177;0．6)pmol／min&;#183;mg，t=2．55，P&;lt;0．05]，但上皮化前后使用无差异(P&;gt;0．05)。上皮化后60d时，上皮化前后使用IFN-γ的瘢痕增生数分别为8和9个，低于对照的24个(χ^2=13．33和11．61，P&;lt;0．001)，而且瘢痕增生程度较低，但两组间无差异。结论：IFN-γ延迟创面愈合与其活化PKA有关。增生性瘢痕组织上皮化后PKA活性即下降，而非增生性瘢痕的高活性维持到14d后，且IFN-γ活化非增生性瘢痕组织的PKA，提示PKA活化介导IFN-γ抑制瘢痕增生的信号。     

内眦赘皮矫正同期小切口重睑成形术

目的探讨内眦赘皮矫正术与小切口重睑成形术联合美容手术方法的可行性。方法在设计小切口重睑成形术的同时,在内眦部设计新型的“Z”形切口内眦赘皮矫正术（无皮瓣交错）,上睑的切开线重叠于重睑线,下睑隐藏于睑缘。结果全组56例,均获得令人满意的美学重睑形态和内眦部的良好形状效果。结论由于术式使用小切口的重睑形成方法的同时,采用了内眦赘皮矫正方法,最大限度地减少瘢痕,该手术方法设计简单、操作容易、符合生理要求、术后重睑及内眦形象良好。     

第三方骨髓间充质干细胞诱导同种异体移植受体免疫耐受机制的研究

目的 初步研究第三方骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导同种异体移植受体免疫耐受的作用机制.方法 40只雌性C57BL/6小鼠作为供体,40只雄性BALB/C小鼠作为受体,建立稳定的同种异体皮肤移植模型,BMSCs取自SD大鼠骨髓.将40只BALB/C小鼠随机分为4组,每组10只.①空白对照组:只进行皮肤移植,未给予其他治疗;②环磷酰胺组(CP组):大剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.);③单纯给予SD-BMSCs移植组(SD-BMSCs组):移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs;④细胞药物联合应用组(CP+SD-BMSCs组):大剂量CP腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.),并于移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs.检测指标包括:移植皮片存活情况;SD大鼠BMSCs表面抗原CD29、CD34、CD45和CD90鉴定;流式细胞仪检测受体脾脏调节性T细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg细胞)的比例;ELISA检测受体外周血TGF-β、IL-10、IFN-γ的含量;异基因T淋巴细胞与经60Co照射的不同来源BMSCs共培养后,MTT法测定异基因T淋巴细胞增殖的情况.结果 CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间为(15.7 ±1.4)d,空白对照组为(6.1±1.1)d,CP组为(12.3±1.5)d,SD-BMSCs组为(12.6±1.8)d,CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间明显比后3组延长(P＜0.05).全骨髓贴壁培养的BMSCs表面抗原鉴定:CD29+、CD44+分别为99.7%和96.7%,CD34-、CD45-分别为1.6%和1.3%.流式细胞仪检测Treg含量SD-BMSCs组和CP+SD-BMSCs组明显高于空白对照组和CP组(P＜0.05);ELISA检测受体外局血SD-BMSCs组和CP组TGF-β和IL-10明显高于空白对照组,SD-BMSCs和CP组IFN-γ则明显低于空白对照组(P＜0.05);共培养结果显示:来源于C57小鼠和SD大鼠的BMSCs可以明显抑制T淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),而上述两组组间比较差异则无统计学意义(P＞0.05).结论 第三方BMSCs诱导同种异体移植免疫耐受作用可能与诱导受体Treg细胞增殖和促进免疫耐受因子的表达,抑制免疫排斥因子的表达有关.

Abstract：

Objective To study the immuno-tolerance mechanism of the third-party bone marrowderived mesenchymal stem cells ( BMSCs) in the allogeneic transplantation. Methods Forty female C57BL/ 6 mice and forty male BALB/C mice were respectively used as donors and recipients in skin allogenic graft model. Forty male BALB/C mice were divided randomly into 4 groups: blank control group, CP group, BMSCs group , CP + BMSCs group , with 10 mice in each group. Before skin graft, high-dose abdominal injection of cyclophosphamide ( 200 mg/kg,2 d,q. d. ) was performed in recipient mice in CP and CP + BMSCs groups. On the transplantation day, a bonus of 2 x 106 BMSCs from the SD rat (SD-BMSCs) were injected through the tail vein in the BMSCs and CP + BMSCs groups. The observation and HE staining of skin grafts were used. The expressions of CD29, CD34, CD45 and CD90 of cells were analyzed by using flow cytometry in order to identify BMSCs. The CD4+ , CD25+ , Foxp3+ and Treg cells of spleen were detected by flow cytometry. Cytokine in peripheral blood of recipient mice were measured by ELISA,including TGF-β, IL-10 and IFN-γ. T cells were co-cultured with 60 Co-irradiated bone marrow MSCs from different individuals. The proliferative activity of T cells were evaluated with MTT assay. Results The skin graft survival time was significantly prolonged in the CP + BMSCs group, as compared with that in the blank control group, the CP group, the BMSCs group, respectively. Cells cultured by whole bone marrow adherent cultivation showed CD29+ (99.7% ) ,CD44+ (96.7% ) ,CD34 (1.6% ) ,CD45( 1. 3% ). Compared with the control group and CP group, the ratio of the CD4+ ,CD25+ ,Foxp3+ and Treg cells significantly increased in the SD-BMSCs group and CP + BMSCs group (P ＜ 0. 05). Analysis of peripheral blood by ELISA showed significant high level of TGF-β, IL-10 and low level of IFN-γ in BMSCs group and CP group, compared with that in control group. When co-cultured with BMSCs from different individuals, T- lymphocytes proliferation decreased apparently in SD-BMSCs group and C57-BMSCs group (P ＜ 0. 05) , but there was no significant difference between SD-BMSCs group and C57-BMSCs group ( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The immunotolerance mechanism of the third-party bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the allogeneic transplantation might be associated with its effect on the proliferation of Treg cells and increasing expression of TGF-β and IL-10, decreasing expression of IFN-γ.     

转化生长因子—β1对瘫痕疙瘩成纤维细胞Smad3，7mRNA表达的影响

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）对瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）Smad3，7mRNA表达的影响，以寸步明确TGF-β1在瘢痕疙瘩的发生、发展过程中的重要作用。方法 用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同含量（0，5，50，500pmol/L;Smad3 mRNA 24h,Smad7 mRNA90min）和TGF-β1（500pmol/L）作用不同时间（Smad3 mRNA:1,2,4,24,48h;Smad7 mRNA:0.5,1,1.5,2,4,24h）对Smad3,7mRNA表达的影响。结果 不同含量TGF-β1刺激KFB后，随TGF-β1含量的增加，Smad3 mRNA水平逐渐下降，并呈含量依赖性。与Smad3相反，5pmol/L TGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显升高2.6倍（46&;#177;7，对照组13&;#177;7，t=6.150,P=0.0005），并随TGF-β1剂量加大面略有改变，说明KFB的Smad7 mRNA表达对TGF-β1的刺激非常敏感。用TGF-β1刺激细胞后，Smad3 mRNA水平随作用时间延长而逐渐下降，到作用48h后下降到最低（53&;#177;9，对照组18&;#177;8,t=6.011,P=0.0005），显示出时间依赖性；而Smad7 mRNA在细胞受到TGF-β1刺激后120min即达到对照组的2.5倍（73&;#177;11，对照组53&;#177;9,t=5.215,P=0.003),24h后回幕到正常对照水平。结论 TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。