胎鼠原代脊髓神经元分离培养方法的改良

【摘要】 目的：介绍一种改良原代胎鼠脊髓神经元的分离培养方法。方法：取育龄期雄、雌SD大鼠各36只,合笼配种怀孕。取受孕10~12d、13~15d及16~18d的SD大鼠各6只,解剖分离胚胎脊髓,按常规胰酶消化法制备单细胞悬液,应用细胞计数板及台盼蓝染色,在显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率,明确最佳取材胎龄;接着以上述最佳取材胎龄为取材时间点,每组6只孕鼠,按无酶法、胰酶法和Accutase酶法消化三种不同的方法制备单细胞悬液,显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率。接种、纯化细胞并培养1、3、7d后,用倒置相差显微镜观察脊髓神经元生长状态,利用神经元特异性标志物β tubulin Ⅲ与细胞核双标记法鉴定培养脊髓神经元的纯度。结果：孕13~15d组细胞总量和存活细胞量高于孕10~12d组,细胞存活率高于孕16~18d组（P<0.05）。Accutase酶组获取的细胞总量、存活细胞量以及细胞存活率均明显高于常规无酶组及胰酶组（P<0.05）。在倒置相差显微镜下观察发现,脊髓神经元培养7d后,胞体周围逐渐出现光圈,神经突起逐渐伸长,最终形成密集的神经突起网络;与无酶组及胰酶组相比,Accutase酶法分离的脊髓神经元分布更加均匀并且神经突起形成的网更密集。经β tubulin Ⅲ和hoechst33342荧光染色鉴定,Accutase酶组、无酶组及胰酶组三组分离提取培养的脊髓神经元纯度分别为（90.29±2.55）%、（83.51±6.20）%和（88.10±4.07）%,组间无统计学差异（P>0.05）。结论：13~15d胎龄是原代培养脊髓神经元的最佳取材时间;Accutase酶法相较于常规无酶法、胰酶法所获取的脊髓神经元产量更大、生长状态更好,可作为体外研究脊髓神经元病变的细胞模型。