靶向Slug基因诱导PUMA上调增强AsPC-1细胞对γ射线的敏感性研究

目的 探讨siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌AsPC-1细胞γ射线敏感性的影响。方法 以0、10、50、100感染复数(MOI)的rAAV-EGFP-Slug-siRNA(Slug-siRNA)转染AsPC-1细胞72 h,免疫组织化学法和Western blotting检测转染前后细胞内Slug和PUMA表达。采用4 Gy γ射线细胞进行照射,MTT比色法和Hoechst 33342和PI双染法检测对照组、转染组(MOI 50)、照射组、转染(MOI 50)+照射组细胞存活率和凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,Giemsa 染色观察细胞形态。结果 细胞受到MOI为10、50、100作用72 h后,Slug 蛋白表达相对值分别为0.831±0.14、0.546±0.12和0.178±0.08,明显低于对照组1.17±0.152, 差异有统计学意义(F= 4.992,P<0.05);而细胞受到MOI为10、50、100作用72 h,PUMA 蛋白表达相对值分别为0.325±0.07、0.593±0.11和0.978±0.12,明显高于对照组0.143±0.04, 差异有统计学意义(F= 4.324,P<0.05);转染(MOI 50)+照射组细胞增殖抑制率为(78.76±9.36)%,明显高于转染组和单独射线照射组[(43.68±6.71)%和(19.25±3.72)%],差异有统计学意义(F=5.056,P<0.05)。另外,转染(MOI 50)+照射组细胞的凋亡现象较其他组更加明显。结论 siRNA干扰Slug基因表达能够解除Slug对PUMA的抑制,增强胰腺癌细胞对γ射线的敏感性。     

转染碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达及调控系统的建立

背景：作者前期研究已经成功将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor, bFGF)基因转入鼠眼外肌的肌卫星细胞中，证明其能够在眼外肌的成肌细胞中表达并促进细胞增殖，促进其分化能力。 目的：进一步探讨转染后碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达的调控方法。 方法：将目的基因碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA连接，通过经菌落PCR和酶切鉴定的阳性克隆测序和EcoRⅠ and Hind Ⅲ双酶切处理和Xho Ⅰ单酶切处理验证。筛选并确定C2C12成肌细胞的抗生素的敏感性。通过脂质体转染技术，建立C2C12稳定表达pcDNA6/TR细胞系，经Western blot (蛋白印迹法)鉴定。将pcDNA4/TO/myc-孙HisTMA-bFGF转染到pcDNA6/TR-C2C12细胞系，免疫荧光法及Western blot法检测碱性成纤维细胞生长因子在四环素诱导的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的C2C12细胞内的表达及其分泌情况，并设对照。 结果与结论：①经测序对照，双酶及单酶切处理均证实碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA成功连接。②blasticidin对C2C12细胞的最小致死浓度为10 mg/L，zeocin对C2C12细胞的最小致死质量浓度为750 mg/L。③建立的pcDNA6/TR- C2C12细胞系正确。④经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA- bFGF的成肌细胞基因表达阳性，未经处理的则为阴性；经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc- HisTMA-bFGF的成肌细胞产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白，24 h达高峰，未处理的则不能产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白。结果提示应用四环素抑制调节系统，可以调节碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中的表达。