稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌在评估不同灭菌方法中的应用

目的构建稳定表达荧光素酶基因（lux）的产酸克雷伯菌,旨在更直观地观察产酸克雷伯菌（K. oxytoca）在宿主体内的分布以及评估不同杀菌方法的效果。 方法扩增pBAV1k-T5-Lux质粒的荧光素酶基因簇（Lux A/B/C/D/E）,构建含有Lux A/B/C/D/E基因簇的pBBR1质粒（pBBR1-lux）,并获得能够表达荧光素基因基团的大肠埃希菌（E. coli-pBBR1-lux）。将pBBR1-lux质粒电转化至产酸克雷伯菌感受态细胞,经荧光强度鉴定及菌株的3次传代,筛选能够稳定表达lux基因的产酸克雷伯菌（K. oxytoca-pBBR1-lux）。 结果连接成功的环状质粒产物命名为pBBR1-lux。与大肠埃希菌对照株相比,含E. coli-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值显著升高[15 345（14 676,18 654） vs. 63（60,82）],差异具有统计学意义（t = 21.14、P = 0.035）。K. oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值[399 303（265 245,617 192）]显著高于产酸克雷伯菌对照菌株[83（63.5,86.75）],差异具有统计学意义（t = 7.07、P = 0.014）。E. coli-pBBR1-lux和K. oxytoca-pBBR1-lux均能够在Veritas微孔板光度计和小动物成像仪上检测到Luminesence荧光信号。将所得菌株按照1︰10稀释6个梯度,荧光值检测结果显示,Luminesence值随菌落浓度降低而下降。多次传代后pBBR1-lux能够在产酸克雷伯菌中稳定表达荧光素酶,不同理化杀菌方法对产酸克雷伯菌杀菌效果不同,紫外线和84消毒液（10%）是最有效的杀灭产酸克雷伯菌方法。 结论本研究获得了可被微孔板光度计和小动物成像仪检测到的稳定表达荧光素酶的K. oxytoca-pBBR1-lux。     

脂肪肝患者ALT、AST、γ-GT水平及意义

目的探讨脂肪肝患者血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)水平及意义。方法选取2017年1月~2018年8月在火箭军特色医学中心治疗的脂肪肝患者110例(观察组),其中酒精性脂肪肝患者46例,非酒精性脂肪肝患者64例;轻度患者32例,中度患者51例,重度患者27例。同时选取健康志愿者100例作为健康对照组。检测并比较两组血清ALT、AST、γ-GT水平。结果观察组血清ALT、AST、γ-GT分别为(38.10±8.21)U/L、(29.03±6.12)U/L和(45.59±12.12)U/L,明显高于健康对照组,而AST/ALT为(0.76±0.20)明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组酒精性脂肪肝AST、AST/ALT和γ-GT为(32.10±5.83)U/L、(0.83±0.20)和(67.82±9.29)U/L,明显高于非酒精性脂肪肝,差异有统计学意义(P<0.05);观察组重度患者ALT、AST和γ-GT分别为(42.59±7.23)U/L、(32.37±3.18)U/L和(54.40±9.99)U/L,明显高于轻度和中度患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论脂肪肝患者ALT、AST及γ-GT有所升高,与脂肪肝类型及严重程度有一定关系。     

中性粒细胞对动脉粥样硬化免疫机制影响的研究进展

动脉粥样硬化（AS）与脂质代谢紊乱、炎症密切相关。AS炎症不仅局限于血管局部,还包括多种免疫细胞异常导致的全身免疫紊乱。既往认为参与AS的免疫细胞以单核-巨噬细胞为主。中性粒细胞是天然免疫系统中数量庞大、高效应答的细胞群,但由于寿命短、更新迅速,在AS中的作用未引起足够重视。在AS炎症反应早期,中性粒细胞可诱导内皮功能障碍、促进泡沫细胞形成和炎症反应,加速AS斑块形成、发展;在AS炎症反应后期,中性粒细胞参与斑块内血管损伤、坏死核形成和纤维帽变薄,促进不稳定斑块破裂,并激活血小板,继发血栓形成。因此,调控中性粒细胞可能是防治AS的新靶点。     

转化生长因子β_1刺激肝星状细胞差异表达下调基因筛选

目的筛选并克隆转化生长因子β1(TGF-β1)刺激肝星状细胞差异表达下调基因,阐明TGF-β1导致肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGF-β1及磷酸盐缓冲液分别刺激大鼠肝星状细胞(即实验组和对照组),提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将对照组细胞cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与实验组细胞cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF-β1刺激肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到98个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。选取含有插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得了19种已知基因序列和2个未知功能基因。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF-β1刺激的肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明TGF-β1参与肝纤维化的分子生物学机制提供了理论依据。     

肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响

目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。     

GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程相关性分析

目的 探讨GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程的相关性.方法 通过抗原表位预测软件BepiPred 1.0Server将GLT25D1基因片段分为GLT25D 1-1和GLT25D 1-2两部分,PCR扩增获得目的片段,构建其原核表达质粒；对制备的多克隆抗体进行效价及特异性分析.通过以GLT25D1为抗原的ELISA双抗体夹心的方法,检测其在HBV感染不同阶段的患者的血清水平.结果 成功表达重组蛋白,Western blot鉴定正确；成功制备兔抗人(GLT25D1-1、GLT25D 1-2)的多克隆抗体,效价较高,特异性良好.通过ELISA方法检测HBV感染患者血清,慢性乙肝(病理结果不超过S3期)、肝硬化(S3-4期及S4期)以及肝癌患者中GLT25D1的OD值较正常组均有显著性差异(P＜0.01).结论 通过血清学检测结果,我们发现GTL25D1存在于HBV感染的肝病的各进程中,进而我们推测血清GLT25D1可能会作为检测肝纤维化进程的一个新的血清学指标.     

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.     

高脂血症对炎性免疫应答的影响

目的：观察高脂饮食对C57 BL/6和apoE基因敲除（apoE-/-）小鼠免疫应答的影响。方法12周龄雌性C57BL/6和apoE-/-小鼠分别给予普通饲料和高脂饲料。4周后,检测血脂水平、外周血粒细胞和单核细胞比例,及其表面受体CD36的表达水平;进一步采用脂多糖（LPS）刺激检测血浆细胞因子的水平。结果4周高脂饮食导致C57 BL/6小鼠血浆总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）显著升高。apoE-/-小鼠TC、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）水平显著升高,HDL显著下降;高脂饮食可进一步升高其TC、TG、LDL和HDL水平。4周高脂饮食C57 BL/6小鼠外周血粒细胞和单核细胞比例无明显改变;apoE-/-小鼠外周血粒细胞的比例显著增多;高脂饮食导致apoE-/-小鼠单核细胞的比例显著增多,外周血粒细胞和单核细胞表面CD36的表达水平显著增高。采用LPS腹腔注射,发现高脂饮食致野生型小鼠血浆IL-1β、IFN-γ、MCP-1和IL-6水平显著升高;apoE-/-小鼠血浆IFN-γ和IL-6表达显著增加,高脂饮食apoE-/-小鼠血浆IL-1β、IFN-γ、MCP-1和IL-6水平显著升高。结论长期的高脂饮食不仅导致高脂血症,同时还引发了系统性炎症反应。     

医学实验室常见学生生物安全问题及其应对

在整个传染病医学实验过程中,学生是暴露感染的高危人群。本文从造成自体损伤、他人损伤和环境污染3个方面分析医学实验室常见的生物安全问题或潜在风险。提出从加强安全意识教育、加强安全再培训、定期开展生物安全演练3个方面入手,开展有针对性的生物安全培训,规范学生安全操作。在此基础上,通过不断加强学生安全意识教育、强化安全管理机制、提高分区分级管理和现场事故处理能力,完善安全学分管理和安全奖惩机制,全面提高学生生物安全意识,从而达到将医学实验室生物安全风险降至最低水平的目的。     

抑制O-糖基化修饰促进乙型肝炎病毒的释放

目的：探讨抑制O-糖基化修饰对乙型肝炎病毒颗粒组装的影响。方法采用O-糖基化修饰抑制剂Benzyl-α-GalNAc干预HepG2.2.15细胞。经7-AAD染色,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清乙型肝炎病毒大蛋白（the hepatitis B virus large surface protein,HBV LHBs）水平。采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测细胞中LHBs蛋白含量。结果 Benzyl-α-GalNAc能显著促进细胞凋亡,上清中HBV DNA和LHBs水平呈剂量依赖性增加;Benzyl-α-GalNAc抑制细胞中LHBs蛋白表达。结论抑制细胞O-糖基化修饰促进细胞凋亡,从而释放HBV LHBs和病毒颗粒;但在某种程度上抑制细胞O-糖基化修饰能够抑制细胞内LHBs合成。