细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase TPx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达,纯化融合蛋白抗原,免疫小鼠制备抗血清。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EgTPx基因,克隆到原核表达载体pET-41b中,转化大肠杆菌BL21,经过IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,通过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化获得重组蛋白并免疫小鼠,制备抗血清。Western blot鉴定抗血清的特异性,ELISA测定抗体的效价。结果用PCR方法扩增获得的EgTPx基因长度为582bp,经酶切鉴定和序列测定,插入到原核表达载体的基因片段为EgTPx基因,SDS-PAGE结果显示表达融合蛋白相对分子质量约为54kDa,鼠抗EgTPx抗体能与融合蛋白和天然原头蚴抗原发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶256000。结论成功地制备了鼠抗EgTPx抗体,并能够特异识别原核表达的融合蛋白EgTPx和天然原头蚴抗原,为研制有效的包虫病疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

应用SSH技术研究H_2O_2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达

目的构建H2O2胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库。方法以H2O2胁迫细粒棘球蚴cDNA为试验方(tester),正常生长的细粒棘球蚴cDNA为驱动方(driver),应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达。结果文库扩增后得到124个阳性克隆,菌落PCR分析,均得到200~1000bp插入片段。将整个文库克隆进行测序,测得序列结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。结论成功构建了H2O2胁迫与正常组织差异表达的消减cDNA文库,为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定基础。     

细粒棘球绦虫EgM123蛋白融合霍乱毒素B亚单位疫苗的构建表达及免疫原性研究

目的 构建和表达细粒棘球绦虫成虫特异表达EgM123基因与霍乱毒素B的融合蛋白(CTB-EgM123);并确定CTB-EgM123蛋白的抗原性。方法 将合成EgM123基因序列连接到pET28a/CTB原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中。利用IPTG诱导目的基因的表达;用SDS-PAGE及Western-Blotting对表达蛋白进行分析和鉴定;用纯化蛋白免疫小鼠及犬,用ELISA方法对小鼠及犬的血清抗体效价和肠黏液的抗体亚类进行分析。结果 PCR和测序确定CTB-EgM123基因片段长度为804 bp,pET28a/CTB-EgM123原核表达阅读框序列正确。在37 ℃条件下,经IPTG 0.4 mmol/L诱导5 h,获得CTB-EgM123高表达的包涵体蛋白,分子质量为37 kDa。免疫小鼠结果表明复性CTB-EgM123蛋白具较好免疫原性,抗体效价> 320 000;以IgG2a为主。检测免疫犬血清效价,结果发现用融合蛋白免疫后的犬血清抗体效价> 64 000,效价高于EgM123免疫组(t=0.0064,P< 0.05);且在4周时,抗体呈上升趋势,并能较长时间维持抗体水平。结论 原核表达载体pET28a/CTB-EgM123在大肠杆菌中成功表达,纯化蛋白接种小鼠和犬表明具有高的抗原性。表明CTB可以增强蛋白的免疫原性,并刺激小鼠和犬体内产生高水平的体液和黏膜免疫。本研究为研发犬用包虫病疫苗奠定了基础。     

绵羊脑多头蚴病45m基因在多头绦虫和细粒棘球绦虫不同发育阶段同源性的比较

目的研究绵羊多头蚴病45M重组蛋白的同源性。方法将多头蚴的45m基因片段亚克隆到pET41b表达质粒,构建45m-pET41b原核表达系统,诱导表达45M重组蛋白,制备小鼠高免血清,进行免疫印迹试验（Western blot）;运用RT-PCR的方法,从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45mA。结果45M蛋白的高免血清可被细粒棘球绦虫不同发育阶段的天然抗原所识别,均在63kD处发生交叉反应;从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45m基因的同源基因,命名为45mA（Gen-Bank号为EU326106）,45m和45mA的核酸序列和蛋白序列分别有86％和76％的同源性;45M和45MA蛋白与细粒棘球蚴的保护性蛋白Eg95有57％的氨基酸同源性。结论提示45m抗原分子在多头绦虫和细粒棘球绦虫的不同发育阶段均存在,为45M蛋白的免疫原性的分析提供了宝贵的资料。     

细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx的免疫定位

目的：研究抗重组细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx（rEgTPx）多克隆抗体对天然EgTPx的结合活性，探讨EgTPx在原头蚴内的分布。方法：采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，在无菌条件下收集包囊内的原头蚴，经消化处理后制备石蜡切片。利用rEgTPx多克隆抗体，以间接免疫荧光法确定抗氧化蛋白EgTPx在原头蚴内的分布。结果：rEgTPx多克隆抗体能够特异性地结合天然EgTPx抗原表位，EgTPx广泛分布在原头蚴的体表皮层、皮下层和钙颗粒细胞内。结论：确定了EgTPx蛋白在细粒棘球绦虫原头蚴内的分布，为研究EgTPx在原头蚴发育的生物功能奠定基础。     

麝香保心丸治疗急性心肌梗死的临床观察

目的:观察麝香保心丸(HMP)对急性心肌梗死(AMI)急性期治疗和梗死后早期二级预防的作用.方法:急性心肌梗死患者50例随机分为HMP治疗组(Ⅰ组)和安慰剂对照组(Ⅱ组)观察治疗前后心室壁运动、心脏功能、左室重塑变化及严重心脏血管事件(MACE)和再住院(RH)的发生率.应用心脏彩色超声仪测定治疗前后室壁运动指数(RWNI),左室结构及心功能相关指标,采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定细胞凋亡抑制因子(Fas/AP0-1).结果:HMP40mg日3次,口服3个月室壁运动指数RWNI明显改善(p＜0.05),左室收缩末期容量(LVESV)、左室舒张末期容量(LVEDV)明显下降(p＜0.01),左室射血分数(LVEF)明显升高(p＜0.01),左室舒张早期和左室舒张晚期血流峰值比(EP/AP)明显改善(p＜0.05),左室重塑受抑,球体指数(SI)无明显改变(p＞0.05),血清细胞凋亡抑制因子较对照组明显减少(p＜0.05),严重心血管事件和再住院发生率减少(p＜0.05或0.01).结论:AMI加用HMP治疗可明显减少心肌细胞凋亡、改善室壁运动指数、减少梗死面积、改善心脏功能、防治左心室重塑,减少严重心血管事件和再住院发生率,具有较高的临床安全性和顺应性,有益于AMI的急性期治疗和AMI后早期的二级预防.     

抗细粒棘球绦虫基因工程疫苗的研究进展

棘球蚴(包虫)病又称囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE).棘球蚴体积大,生长力强,可寄生于人畜体内许多脏器中,压迫周围组织使之萎缩和功能障碍.如果棘球蚴囊破裂,易造成继发性感染,还能引起宿主产生过敏反应,甚至死亡.是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病[1].     

吡喹酮定型药饵驱除犬细粒棘球绦虫的药效试验及饵性观察

本试验以5.0、2.1和1.7mg/kg剂量吡喹酮(praziquantel)定型药饵,即药饵Ⅳ,并和吡喹酮原粉对比,对口服原头节实验感染细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)后39天以上的家犬进行了驱虫试验。该药饵的5.0、2.1mg/kg剂量组均获得了100％的驱虫率,但2.1mg/kg剂量的原粉,仅取得80％的驱虫率,1.7mg/kg剂量吡喹酮药饵Ⅳ也仅获得80％的驱虫率。该药饵在11872犬次作小区应用,自动吞服率为83.2％,保持了良好的饵性。     

细粒棘球绦虫分泌抗原B调控Th17/Treg抑制过敏性哮喘的研究北大核心CSCD

目的探讨细粒棘球蚴分泌抗原B(EgAgB)对过敏性哮喘的抑制作用及其机制。方法将32只小鼠随机分为4组(每组8只),其中A组为高剂量干预组(HAgB:20μg EgAgB+OVA),B组为低剂量干预组(LAgB:2μg EgAgB+OVA),C组为过敏性哮喘组(OVA),D组为PBS对照组。采用ELISA法检测小鼠抗体水平;HE、PAS组织染色检测小鼠肺组织病理变化及黏蛋白分泌水平;利用流式细胞术分析肺脏和脾脏组织中淋巴细胞的分群及活化比例。结果 EgAgB免疫小鼠血IgG、IgM和IgG2b抗体水平显著高于PBS对照组(D组)(P<0.01),IgG1、IgG2a和IgE水平与PBS对照组(D组)相比差异无统计学意义(均P>0.05);HE、PAS染色显示,EgAgB接种组与C组相比能够显著抑制小鼠气道炎症及气道粘液的分泌(均P<0.01);流式细胞术检测显示,免疫高剂量EgAgB组小鼠肺组织及脾脏组织嗜酸性粒细胞和Th17的数量显著减少(均P<0.01),Treg数量显著增多(P<0.01)。结论 EgAgB能够通过调节宿主免疫平衡抑制过敏性哮喘,可作为防治自身免疫性疾病和过敏性疾病的候选小分子蛋白。