新等位基因人类白细胞抗原B*4609的发现和确认

目的 鉴定一个人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*4609.方法 使用序列特异性寡核苷酸PCR技术进行HLA基因分型,发现反应格局异常的可疑新等位基因,应用分子克隆和DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析.结果 检出1个样本HLA-B位点反应格局异常,DNA测序分型结果一个为B*151101,另一个的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因序列与同源性最高的HLA-B*460101基因序列相比,在第3外显子区域中527位碱基发生A→T突变,导致176位编码氨基酸由谷氨酸(GAG)变成缬氨酸(GTG).结论 样本中含有HLA-B新等位基因序列.该序列申报后,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4609.     

CIK细胞临床应用技术规范探讨

 细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokin induced killer cells，CIK细胞）因具有体外增殖倍数高、抗瘤谱广、杀瘤活性强、副作用极小等特点而受到关注。研究表明，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是LAK细胞的100倍[1]。CIK细胞过继性免疫治疗是肿瘤治疗中的一项新技术，目前已逐步在临床上应用，因此，制订科学、严格的技术规范对该技术的正确使用及推广意义重大。但迄今国内还没有关于CIK细胞培养和临床应用的统一技术规范。无锡旺庄医院生物治疗中心参考国家食品药品监督管理局1999年制订的《新生物制品审批办法》和美国FDA 1998年制订的《人体细胞治疗和基因治疗指导原则》，结合数年的CIK细胞临床应用经验，制订出我们的CIK细胞临床应用技术规范，现介绍如下，供同行切磋和讨论，以期促成全国性统一技术规范的早日制定。     

血液灌流对硫线磷和硫酸阿托品的吸附作用

Objective To study on adsorption effect of cadusafos and atropine sulfate by hemoperfusion.Method Hemoperfusions were performed for sheep blood samples with cadusafos and atropineby through imitated extracorporeal closed circulating perfusion apparatus.Residual cadusafos was determined by gas chromatography and residual atropine was determined by high performance liquid chromatography.Result Dose of adsorption agent was 0.5,1.0 and 1.5 g,respectively.Two hours after hemoperfusion with membrane coated activated charcoal,clearance rate of cadusafos in 3 groups all exceeded 90%.and clearance rate of atropine sulfate was 61.9%,84.9%,88.9%,respectively.One and a half hours after hemoperfusion with HA230 absorption resin,clearance rate of eadusafos in 3 groups all exceeded 90%,and clearance rate of atropine sulfate was 88.0%,97.2%,98.4%,respectively.Three hours after hemoperfusion with membrane coated activated charcoal,The concentration ratio of cadusafos and atropine sulfate in blood promoted to 10.1 times,and the ratio was 6.7 times after hemoperfusion with HA230 absorption resin.Conclusion It suggested that cadusafos were mostly removed from blood after 1.5～2.0hours hemoperfusion with membrane activated charcoal or HA230 absorption resin.The concentration ratio of cadusafos and atropine sulfate in blood will increased after hemoperfusion.     

我国HIV-1 B''亚型毒株gag基因变异特征研究

目的研究我国人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B’亚型主要流行株在宿主免疫压力下的基因变异及抗原表位的变化特征，探讨选择压力、基因离散率和抗原表位变化之间的关系。方法从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增后，将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析，使用GCG软件包的Distance程序对P17和P24两个区段计算基因距离，用Diverge程序计算同义替换（1（s）和非同义替换（1（a）及二者之间的比值，并对我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况进行分析。结果HIV-1B’亚型毒株的P17区段的Ks／Ka值〈1，而P24区段的Ks／Ka值〉1；P24部分的基因离散率低于P17部分；P17区段抗原表位的保守率为34．94％，而P24区段抗原表位的保守率为67．38％；从基因离散率、所受的选择压力及抗原表位的突变率3个方面来看，HIV-1的P17区段均明显大于P24区段。结论HIV-1B’亚型毒株的P17区段的抗原表位变化较大，而P24区段的抗原表位相对较为保守。提示P24区段的CTL表位更适合于表位疫苗的研制。     

森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

转入IL-18 cDNA的鼻咽癌细胞在hu-PBL-SCID鼠中致瘤性的影响

为了探讨人白细胞介素 18(hIL 18)的表达对鼻咽癌细胞体内致瘤性的影响 ,我们构建了hIL 18的真核表达载体pcD NA3/hIL 18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE细胞 ;然后以转染阳性的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞接种到用健康人外周血白细胞免疫重建的SCID鼠 (hu PBL SCID鼠 ) ,观察成瘤情况。结果发现 ,所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL 18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL 18的含量为 (85± 10 )pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL 18的含量低于 5pg/ml。将转染阳性的细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种hu PBL SCID小鼠后连续观察 5 0d ,发现前者形成的肿瘤其生长速度明显慢于后者 ,其平均瘤重也有显著性差异 (P <0 0 0 1)。说明在体内hIL 18的表达能有效地抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用。     

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18 L1－E6，L1－E7嵌合基因的表达载体，并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV18 L1－E6和L1－E7基因，插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法，突变L1－E6，L1－E7基因序列中与转化作用相关的位点，分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX-1L1 E6Mxx,L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法，转染CHO细胞，以抗HPV－18L1，抗E6和抗E7特异性单克隆抗体（mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示，转染各种pVAX1-LIE6Mxx-L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P－N值均＞2．1；免疫细胞化学检测，在胞浆，胞核可见棕黄色颗粒。结论 我建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白质表达质粒，可在转当细胞内表达相应的L1－E6Mxx和L1－E7Mxx蛋白，为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒的免疫原性分析

目的　研究重组人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV 6 )病毒样颗粒(virus likeparticle ,VLP)的免疫原性。方法　重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的HPV 6L1VLP(L1 VLP)和HPV 6L1+L2VLP(L1+2 VLP)经鉴定后 ,用于免疫BALB/c小鼠 ,对诱导的体液免疫和细胞免疫反应进行了检测。结果　电镜观察显示L1 VLP和L1+2 VLP二者形态上无明显差异 ,为圆形颗粒 ,直径约 5 0nm ,SDS PAGE和Westernblot分析表明 ,L1+2 VLP中L1和L2蛋白摩尔比例为 4∶1。用ELISA法测定免疫小鼠血清抗体滴度 ,加佐剂L1 VLP免疫组和加佐剂L1+2 VLP免疫组血清针对HPV 6L1VLP的滴度在 1∶10 0 0 0以上 ,高于未加佐剂组免疫血清滴度 (1∶2 0 0 0 ) ,L1+2 VLP免疫诱导出了特异于L2抗原的抗体。血清抗体主要识别HPV 6构象依赖性抗原表位 ,与HPV 11抗原显示出一定的交叉反应 ,而与HPV 16无明显交叉反应。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经HPV 6L1VLP再激活后出现了特异性增殖反应 ,3H TdR掺入值与未免疫组之间差异有显著性 (P <0 .0 1) ,L1 VLP和L1+2 VLP两组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,L1 VLP和L1+2 VLP免疫组刺激指数 (SI)分别为 6 .4和 6 .2 ,阴性对照组SI为 1.1。HPV 6L1VLP再刺激特异地诱导免疫组脾淋巴细胞IL 2和IL 10分