姜黄素衍生物体外释放及抗肿瘤作用研究

目的 研究姜黄素衍生物mPEG_2k-Gly-Cur,mPEG_2k-Gly-Cur-OA和Cur-OA₂的体外释放情况及其体外抗肿瘤作用。方法 采用高效液相色谱法,进行姜黄素衍生物在人肝癌细胞株HepG2培养上清液中水解释放特性的研究;采用MTT法对各姜黄素衍生物体外抗肿瘤细胞活性进行初步评价。结果 建立了姜黄素的HPLC检测条件,在灭活的细胞培养上清液中,mPEG_2k-Gly-Cur和mPEG_2k-Gly-Cur-OA可以以相对合适的速度缓慢释放姜黄素,而Cur-OA₂释放非常缓慢;但在未灭活处理的细胞培养上清液中姜黄素衍生物释放速度均明显加快,表明衍生物可以通过酶促反应加速释放。体外MTT实验证实3个姜黄素衍生物具有较好的抗肿瘤作用,而且Cur-OA₂活性最强,但相对游离姜黄素均有所下降。结论 姜黄素酚羟基经衍生化后可有效提高水溶液中稳定性,而油酸双酯化衍生物可能通过肝癌细胞吞噬作用增强药效,值得进一步深入的系统研究。     

白及有效部位诱导HL60细胞凋亡及其作用机制的研究

目的：研究白及有效部位诱导HL60细胞凋亡及其作用机制。方法：采用乙醇回流提取白及,系统溶剂萃取法萃取后得到白及氯仿层,采用folin-酚比色法测定氯仿层的总酚含量。将白及氯仿层配成50、100、150μg/mL后,作用于HL60细胞,应用Hoechst33342染色和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化,应用流式细胞术分析白及氯仿层对细胞凋亡的影响,并用RT-PCR法检测Bcl-2和BaxmRNA的表达。结果：白及氯仿层总酚含量为25.35%,药物对HL60细胞作用24h后,Hoechst33342染色后荧光显微镜下可见明显的胞核固缩、深染及碎裂等多种形态改变,透射电子显微镜下可见典型的凋亡细胞,流式细胞仪分析结果显示,白及氯仿层可显著诱导HL60细胞凋亡,凋亡率为24.9%,36.0%,51.3%,RT-PCR结果显示,Bcl-2mRNA的表达随着药物浓度增加而下降,BaxmRNA表达增加。结论：白及能有效诱导HL60细胞凋亡,抑制HL60细胞增殖,其机制可能与Bax基因表达增加及Bcl-2基因表达降低有关。     

FPPF利用ISSR分析浙产白及种质资源的遗传多样性

目的:在分子水平上对浙产野生白及进行遗传多样性研究,以确定浙产白及生物多样性现状,为有效保护浙产白及种质资源提供理论基础。方法:采用简单重复序列区间(ISSR)标记技术对浙江九个不同产地白及进行研究,通过UPGMA聚类进行分析。结果:从45个ISSR随机引物中筛选出12条引物,共扩增出164条条带,其中多态性条带143条,多态性达87.19%,品种之间的遗传相似系数范围在0.59～0.76间;聚类分析结果显示九个浙产白及分为两大分支:杭州、宁波和德清为一支,淳安、天台、温州、临安、嘉兴、衢州为另一支。结论:浙产白及遗传多样性较低,可引进外来品种或通过杂交育种的方式丰富浙产白及种质资源,并需要对白及种质资源进行有效的保护和合理的利用。     

高效液相色谱法同时测定牡蒿叶中4个绿原酸类成分含量

[目的]通过响应面法优化提取工艺,并结合高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定牡蒿叶中4个绿原酸类成分的含量,探究其开发利用价值。[方法]采用Thermo Scientific Syncronis Amino色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)色谱条件为流动相乙腈:0.1%甲酸水(40:60,V/V),流速1mL·min~(-1),柱温25℃检测波长325nm;以绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的总含量为响应值乙醇浓度、液料比、超声功率为主要因素采用Box-Behnken响应面法对牡蒿叶中4个绿原酸类成分进行优化提取,并测定其含量。[结果]以乙腈:0.1%甲酸水(40:60,V/V)等度洗脱,流速1mL·min~(-1),柱温25℃检测波长325nm,牡蒿叶中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C分离度良好,在6.25～200.00μg·mL~(-1)浓度范围内线性关系良好加样回收、精密度、稳定性和重复性均符合要求。优化得到的最佳提取工艺为:乙醇浓度60%,液料比40:1(单位mL·g~(-1))超声功率250W频率53kHz室温超声20min。通过HPLC法测得绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C含量分别为14.317 0mg·g~(-1)、27.945 2mg·g~(-1)、1.2304mg·g~(-1)和5.066 5mg·g~(-1),合计总量达48.559 0mg·g~(-1)。[结论]HPLC法测得牡蒿叶中绿原酸类成分含量较为丰富。采用响应面法优化提取工艺,能够显著提高牡蒿叶中4个绿原酸类成分提取率具有较好潜在开发应用价值。     

聚乙二醇负载葛根素前药的合成、表征及体外特性初步研究

 目的 合成水溶性好,具有缓释特性并无溶血不良反应的葛根素前药。方法 通过缩合反应以丁二酸为连接臂,将葛根素与单甲氧基聚乙二醇（M_r=5 000,mPEG_5k共价连接,制备聚乙二醇负载的葛根素前药,并通过TLC,UV,1H-NMR 对其进行结构表征;同时测定葛根素前药的水溶性;考察前药在不同pH缓冲液中的释药特性;初步探索前药体外溶血特性。结果 合成了聚乙二醇负载的葛根素前药,鉴定为预期产物。其水溶性较葛根素有较大提高;该前药在酸性的条件下稳定性较好,在pH 7.4的生理环境下能够缓慢持续的释药;体外抗溶血特性研究实验结果表明,该前药可避免葛根素的溶血性不良反应。结论 与葛根素相比,前药水溶性好,并具有一定的缓释效果,而且可以避免溶血特性,有望成为新一代的葛根素制剂。     

山核桃叶提取物体外对HepG2细胞增殖抑制作用研究

目的研究山核桃叶提取物体外对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用及其可能机理,为进一步开发利用山核桃奠定基础。方法采用系统溶剂法将山核桃叶70%乙醇浸膏分成五个部位,然后通过MTT法观察其对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用,并通过吖啶橙染色法和流式细胞术观察其诱导凋亡作用。结果山核桃叶氯仿层和石油醚层对HepG2细胞均具有较强的增殖抑制作用,氯仿层相对较强,IC50为（49.70±4.42）mg.L-1,并可剂量依赖性诱导HepG2发生细胞凋亡,其中100mg.L-1处理组凋亡率达28.0%。结论山核桃叶氯仿层中和石油醚层含有抗肿瘤活性成分,其中诱导细胞凋亡是氯仿层提取物发挥抗肿瘤活性的作用机理之一,值得进一步深入研究。     

新型阳离子脂质体制备及其体外转基因特征

背景：阳离子脂质体及胶束、纳米粒等转基因载体是目前非病毒转基因载体领域研究热点;而目前市售转基因试剂盒价格昂贵,并且基本上都是进口商品,如果能够开发一种价廉,转基因效率高,具有自主知识产权的转基因试剂盒将展现广阔市场前景。 目的：合成一种新型阳离子脂质复合物,并制备相应阳离子脂质体,对其体外转基因效率进行考察。 方法：以1-乙基-3- (3-二甲胺丙基)碳二亚胺、胆固醇、丁二酸酐为原料合成阳离子脂质复合物,采用薄层色谱、红外光谱等方法对产物进行结构表征。然后用薄膜分散法,将适当比例的二油酰磷脂酰乙醇胺和阳离子脂质复合物混合制备成阳离子脂质体,并用其包封含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFPC1,对人宫颈癌Hela细胞株进行体外转染。 结果与结论：通过两步法合成了一种全新的阳离子脂质复合物——胆固醇-丁二酸酯-1-乙基-3- (3-二甲胺丙基)碳二亚胺,薄层色谱及红外光谱结果表明合成了预期产物。薄膜分散法制得阳离子脂质体,其中以这种阳离子脂质复合物和二油酰磷脂酰乙醇胺摩尔比为1∶1左右所制备的脂质体颗粒较为均匀、细小,形态基本呈圆形。体外对质粒包裹实验结果表明,阳离子脂质体与质粒比为5∶3,可完全包封质粒。用该阳离子脂质体对Hela细胞进行转染,24 h后,瞬时转染效率达35.6%。从初步实验结果看,所合成的阳离子脂质复合物结构总体与市售阳性成分结构类似,合成方法简单、廉价,体外对质粒DNA有很好包裹性能,细胞毒性低,然而体外对Hela细胞的转染效率还明显偏低。     

参麦总皂苷抗血管生成作用研究

目的:探讨参麦总皂苷抗血管生成作用,为临床辅助抗肿瘤分子机理提供理论依据。方法:提取参麦总皂苷,采用MTT法及刮痕法分析总皂苷对人脐静脉内皮细胞HUVECs的增殖和迁移抑制作用;通过荧光定量PCR方法考察总皂苷对人肝癌HepG2细胞株VEGF表达影响;最后,以鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)在体模型对总皂苷抗血管生成作用进行评价。结果:MTT及刮痕实验结果表明,参麦总皂苷可剂量依赖性抑制HUVECs细胞增殖和迁移,其中600μg/mL浓度增殖抑制率达63.9%,150μg/mL处理48h,其迁移抑制率可达73.7%;荧光定量PCR结果表明,总皂苷可以抑制HepG2细胞分泌VEGF;此外,鸡胚绒毛尿囊膜模型证实,参麦总皂苷具有抗血管生成作用。结论:参麦总皂苷可以通过抑制内皮细胞增殖、迁移及抑制癌细胞分泌VEGF表达起到抗肿瘤血管生成作用。     

采用种子直播技术快速繁殖石斛

目的:建立石斛种子自然繁殖技术体系,为石斛的繁殖提供一种新的途径.方法:以铁皮石斛种子为材料,研究不同萌发培养液、不同萌发时间和不同播种介质对石斛种子萌发率和成苗率的影响.结果:N6+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA是石斛最佳的萌发营养液,在该营养液萌发30d后播种到营养土:蛭石:珍珠岩=3:1:1的介质中,其成苗率最高,可达85％以上.结论:建立了石斛种子直播体系,该体系能高效快速繁殖石斛.     

参麦总皂苷对人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子-1表达影响的研究

目的：研究参麦总皂苷对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）血管细胞黏附分子-1（VCMA-1）表达的影响,探讨参麦抗肿瘤作用的可能机理。方法：制备参麦总皂苷,以炎症因子TNF-α为诱导物,用一系列浓度的参麦总皂苷进行干预处理HUVEC细胞,采用荧光定量PCR方法和流式细胞仪检测VCMA-1基因的转录和表达情况。结果：TNF-α可剂量依赖性诱导HUVEC细胞表达VCMA-1,其中20ng/ml为合适诱导浓度;参麦总皂苷可以从mRNA水平和蛋白质水平显著抑制TNF-α诱导的VCMA-1表达,并且与剂量呈正相关,但对正常HUVEC细胞的VCMA-1表达没有明显影响。结论：参麦总皂苷对TNF-α诱导的HUVEC细胞VCMA-1表达有抑制作用,提示其具有抗肿瘤转移作用。