基于数据融合和多指标定量对滇龙胆产地鉴别和质量评价

中药次生代谢产物积累和产地密切相关,产地鉴别以及多指标评价对保证药材质量具有重要意义。该实验采用高效液相色谱(HPLC)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)数据融合结合偏最小二乘判别分析对滇龙胆进行产地鉴别,辅以多指标成分含量分析,以期为滇龙胆药材建立一种全面准确的鉴别和质量评价方法,为滇龙胆最佳产区筛选提供参考。采集云南、四川、广西、贵州共169份样品的FTIR和HPLC指纹图谱,并对FTIR进行多元散射校正、标准正态变量(SNV)、Savitzky-Golay(SG)卷积求导等预处理;比较FTIR,HPLC及低级、中级数据融合鉴别效果;利用HPLC分析样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸与当药苷含量。结果发现,不同产地滇龙胆FTIR图谱存在差异,最佳预处理为SNV+SG求导(二阶求导,窗口参数为15,多项式次数为2次)。低级、中级数据融合预测集正确率为96.43%,高于FTIR,HPLC预测集正确率94.64%;低级数据融合训练集正确率为100%,优于中级数据融合99.12%。云南滇龙胆4种环烯醚萜苷含量均高于其他省份,其中药典指标性成分龙胆苦苷平均质量分数为47.40 mg·g~(-1),最大值达到79.83 mg·g~(-1),且龙胆苦苷、马钱苷酸与当药苷含量同其他省份含量差异显著(P0.05)。云南省不同地区滇龙胆4种环烯醚萜苷总含量比较发现,大理洱源、丽江玉龙较高,分别为68.59,66.68mg·g~(-1),同楚雄武定、玉溪澄江、昆明寻甸(52.99,52.29,46.71 mg·g~(-1))差异显著(P0.05),可作为滇龙胆栽培和优良种质资源筛选的参考地。FTIR-HPLC数据融合定性分析结合HPLC定量分析方法为不同产地滇龙胆鉴别和质量评价提供一种全面准确的新思路,为滇龙胆资源开发与利用提供科学依据。     

滇龙胆丛芽高效诱导与植株再生体系的建立

目的以滇龙胆Gentiana rigescens带叶茎尖、带芽茎段、叶片、根为外植体,建立滇龙胆高效、稳定的丛芽诱导体系,筛选出适宜的植株再生途径。方法以MS为基本培养基,在单因素实验的基础上,通过L16(45)正交及完全组合实验研究不同外植体和不同植物激素种类及其质量浓度对愈伤组织诱导、丛芽发生及植株再生的影响。结果带芽茎段为间接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L中培养10 d、节上腋芽开始萌发后,基部可诱导出再分化能力极强的愈伤组织,得愈率为97.73%;15 d后愈伤组织开始分化出绿色丛芽,分化率100%;30 d后不定芽分化系数达18.65,增殖系数可达63.58。带叶茎尖为直接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5mg/L中培养30 d后,增殖系数亦可达44.36。2种材料培养获得的试管苗茎细瘦弱,不利于生根培养,试管苗在MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L+PP333 10 mg/L中培养60 d后可获得健壮度大为改善的复壮苗。复壮苗生根则在1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 2.0 mg/L中进行,45 d后可获得生长健壮的再生植株,生根率100%。再生苗移栽成活率达95%以上。结论建立的滇龙胆无性快速繁殖体系,为保护滇龙胆野生资源、优质种苗繁育提供了有效途径,也为其遗传转化研究奠定了实验基础。     

云当归挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析

目的 对云当归挥发油的化学成分进行分析.方法 采用水蒸气蒸馏法提取云当归挥发油,并通过气相色谱/质谱(GC-MS)联用技术,对其中的化学成分进行分析鉴定.结果 通过计算机检索,鉴定了其中的54个化合物,占挥发油色谱峰总面积的99.21%.主要成分为顺-罗勒烯(45.20%)、α-蒎烯(21.61%)、Z-双氢藁本内酯(14.10%)、6-丁基-1,4-环庚二烯(2.34%)、双环大香叶烯(2.06%)、E-双氢藁本内酯(1.36%)等.检出成分占挥发油总量的99.26%.结论 为进一步开发利用云当归资源提供了依据.     

绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究

目的 建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法.方法 反相高效液相色谱(RP-HPLC) Planetsil C18分析柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(15∶85),流速为1.0 ml·min~(-1),检测波长为261 nm,柱温为室温.对绒柄牛肝菌有效部位(甲醇提取部位)进行指纹图谱定性分析,对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定.结果 在色谱条件下,11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP-HPLC指纹图谱中可检出11个相对稳定的色谱峰,其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰;绒柄牛肝菌中腺苷的含量为0.146%~0.493%.结论 绒柄牛肝菌有效部位RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性,可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质量控制.     

不同产地野生滇龙胆中主要裂环烯醚萜类成分的含量比较

目的:采用高效液相色谱法测定不同产地野生滇龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷及獐牙菜苷的含量。方法:岛津Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相甲醇-水(30∶70),流速1.0 mL·min-1,龙胆苦苷检测波长270 nm,獐牙菜苦苷及獐牙菜苷检测波长245 nm,柱温25℃。结果:龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的线性范围为0.4～2 mg·L-1;相关系数分别为0.999 7,0.999 6,0.998 7;回收率分别为100.04%(RSD 1.49%),98.48%(RSD 1.67%),98.46%(RSD 1.15%)结论:用本法测定不同产地野生滇龙胆中3种成分含量,方法可行,结果可靠,为野生滇龙胆资源的开发与利用提供资料。     

臭参组培快繁体系研究

目的:建立臭参腋芽增殖和不定丛芽快速繁殖体系,筛选适宜高效的离体再生途径。方法:选取无菌实生苗高位带芽茎段为腋芽增殖材料、基茎不定休眠芽为丛芽增殖材料,采用不同种类和质量浓度的植物激素对外植体增殖及植株再生进行研究。结果:2种外植体中,基茎不定休眠芽是最理想的增殖材料,其继代增殖适宜的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L,增殖系数21.0以上;高位带芽茎段是腋芽增殖的适宜材料,在MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L培养30 d后,腋芽增殖系数为4.55;生根的适宜培养基为30%蔗糖的1/2 MS培养基,30 d后即可获得完整的再生植株,不定根发生率为90.33%;将生根苗炼苗移栽至腐殖质土壤中,成活率达到100%。结论:成功建立了臭参2种离体再生途径。     

滇龙胆环烯醚萜氧化酶基因及启动子的克隆与生物信息学分析

目的从滇龙胆叶片中克隆单萜合成关键酶环烯醚萜氧化酶(GrIDO)基因及其启动子序列,并进行序列分析。方法根据滇龙胆转录组GrIDO基因序列设计基因特异性引物,使用RT-PCR方法克隆GrIDO基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,基于在线软件对GrIDO基因序列进行生物信息学分析。同时,根据GrIDO基因ORF序列,设计特异性引物,采用PCR法对该基因启动子序列进行扩增,并进行序列分析。结果 GrIDO基因(GenBank登录号KP722034)ORF全长1 557 bp,编码518个氨基酸;GrIDO蛋白相对分子质量58 920,理论等电点8.40,属于细胞色素P450超家族成员,可能定位于叶绿体;无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(51.07%)和环(42.69%)构成;GrIDO蛋白与长春花CrIDO蛋白具有较高的相似性(85.83%),且亲缘关系较近。GrIDO基因启动子(GenBank登录号KT428570)长720 bp,具有TATA-box和CAAT-box,还具有参与脱落酸和茉莉酸甲酯应答的顺式作用元件、光应答元件和MYB结合位点。结论GrIDO基因表达受多种因素调控。克隆了GrIDO基因ORF及其启动子,为GrIDO基因的功能验证奠定基础。     

云南黄连自然资源及其保护问题的研究

目的系统调查研究云南黄连的资源分布、生物学和生态学特性、利用历史和现状,为科学保护和合理开发利用这一传统地道药材提供基础资料。方法室内文献资料和标本查阅、药用民族植物学调查和野外考察相结合的方法。结果研究报道云南黄连的生物学和生态学特性、生长发育规律、自然分布特点和利用历史及现状。结论应加强保护野生种质资源和合理开发利用这一药用植物。     

草果的本草考证

草果作为传统药食同源中药,在我国有着悠久的栽培和应用历史。伴随草果开发利用的深入,其经济价值显现,相关产业发展潜力巨大,并在山区扶贫攻坚中扮演重要角色。实际生产和资源利用过程中,草果基原植物较混乱,品种源流、药用历史缺乏系统报道。笔者通过查阅历代本草书籍和文献,对草果名称、植物来源、道地产区变化、传统应用进行考证。结果显示,古代文献中记载草果入药最早为宋代,其别名、异名繁多,古今差异较大,现代记载其别名"红草果""白草果""土草果""草果仁"与草果名称极为相似,但并非一物,应加以区分;明朝时期草果的品种来源复杂,常与豆蔻、草豆蔻归为一类入药,直到清朝《本草从新》才明确将其单列为一种药材,与混淆品区分开;含草果的方剂有草果饮、草果散、草果丸、草果熟水等,其可根据不同病证连皮或去壳以仁入药,以水或酒煎制汤剂为主,另有炒制、盐制、姜制、面粉煨制等炮制方法;历代本草文献中对草果性味归经和功效主治的记载基本一致,认为本品辛温无毒,具有温中止呕、消食导滞、破瘴截疟、逐痰祛邪等功效。以上研究为草果正本清源、药材质量控制及资源开发利用提供了理论依据。     

基于灰色关联度分析法的滇龙胆质量评价

目的:测定不同来源滇龙胆样品中4种指标成分,结合灰色关联度分析(GRA)法建立其质量评价方法。方法:采用高效液相色谱法测定云南10个不同地区的50株滇龙胆根及根茎中主要药效成分马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和当药苷的含量。基于GRA法处理样品各指标成分数据,计算各评价单元序列相对于参考序列的相对关联度作为测度,对样品进行综合评价。结果:建立滇龙胆样品的指纹图谱,并测定出4种主要成分的含量。滇龙胆样品的相对关联度r_i在0.306~0.600,其中14个样品的r_i0.500,23个样品的r_i0.400,表明样品质量之间存在较大差异。大理鹤庆的DH3和DH5的r_i分别为0.600和0.576,质量最优。不同地区样品r_i的平均值在0.325~0.541,鹤庆样品r_i的平均值最大,质量总体水平最高,可作为优质种源进一步研究和推广。各地区样品r_i的RSD在4.4%~11.9%,昆明寻甸样品r_i的RSD最小,样品最为稳定。结论:GRA法结合多指标成分定量的评价方法简单、全面,可用于滇龙胆的质量评价,为资源开发利用及优质种源的筛选提供了参考依据。