CD44~+胃癌细胞的获取及其干细胞特性的初步鉴定

目的:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性疾病发生发展中起重要作用,且是肿瘤治疗失败的根源。胃癌细胞系中同样也存在着肿瘤干细胞。本研究目的是通过筛选人胃癌细胞系SGC-7901细胞中的CD44(+)肿瘤干细胞(CSCs)样细胞,然后对其干细胞特征进行初步鉴定。方法:磁珠分选术(MACS)从胃癌SGC-7901细胞中筛选出CD44(+)胃癌细胞,采用免疫荧光流式细胞术、球状体形成、软琼脂集落形成、FCM等实验对其干细胞特性进行初步鉴定。结果:1.免疫荧光流式细胞术分析结果显示,人胃癌SGC-7901细胞系中只有约2.4%的CD44(+)阳性细胞,经过MACS磁珠分选后,CD44(+)亚群的细胞阳性率可以提高到97.4%。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到无血清培养基中观察球形体的形成,结果发现,CD44(+)细胞形成明显的球状体,CD44(-)细胞不形成球形体(P0.05)。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到软琼脂中观察集落形成,发现CD44(+)细胞群有强大的增殖能力,形成集落大且数量多,而CD44(-)细胞群集落少且小(P0.05)。FCM分析显示:CD44(+)细胞G0/G1期百分率明显高于CD44(-)细胞(P0.05)。CD44(+)胃癌细胞比CD44(-)胃癌细胞具有更强的迁移能力。CD44(+)胃癌细胞的体外侵袭能力比CD44(-)细胞明显增强。结论:所获得的CD44+细胞具有胃癌干细胞特性,可作为今后胃癌干细胞研究的实验基础。     

沉默Chk1基因对DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期的影响

目的：探讨沉默Chk1基因在二烯丙基二硫（DADS）诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用。方法：采用RNAi 技术沉默BGC823细胞Chk1基因,q-PCR与Western blot检测Chk1 mRNA与蛋白表达。流式细胞术检测DADS作用与Chk1基因沉默BGC823细胞周期分布情况。Western blot检测Cdc25C与cyclinB1表达。结果：流式细胞术显示,15 mg·L-1 DADS作用BGC823细胞12、24、36、48 h后,G2/M期细胞呈时间依赖性增加(P<0.05)。Chk1沉默BGC823细胞Chk1 mRNA与蛋白表达下调(P<0.05)。沉默Chk1后,G2/M期细胞较对照组降低(P<0.05)。DADS处理后,对照组G2/M细胞高于Chk1沉默组(P<0.05)。Chk1基因沉默后Cdc25C和CyclinB1表达较对照组增加(P<0.05)。DADS处理对照组后,Cdc25C和CyclinB1表达较未处理组降低(P<0.05)。DADS处理Chk1沉默组Cdc25C和CyclinB1表达较Chk1沉默下调(P<0.05)。结论：Chk1沉默可通过促进Cdc25C和CyclinB1表达减弱DADS阻滞G2/M的作用,DADS阻滞G2/M的检查点是Chk1。     

二烯丙基二硫下调β-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT

目的　研究二烯丙基二硫（DADS）抑制人胃癌MGC803细胞EMT与形态学变化。　方法　应用相差显微镜与透射电镜观察30　mg·L^-1　DADS处理后的MGC803细胞形态学与超微结构的变化。RT-PCR与Western　blot检测β-catenin和EMT标记E-cadherin与Vimentin表达。　结果　30　mg·L^-1　DADS处理MGC803细胞24　h后,相差显微镜显示,与未处理比较,细胞圆形、椭圆形,核浆比值降低,巢状分布,均未见伪足。透射电镜显示,细胞表面微绒毛数目减少,细胞核变规整,核浆比值下降,异型性降低,细胞与细胞之间出现连接结构,细胞器增多。RT-PCR与Western　blot表明,DADS可呈时间依赖性分别下调MGC803细胞β-catenin和Vimentin　mRNA与蛋白和上调E-cadherin　mRNA与蛋白。　结论　DADS可通过下调β-catenin上调E-cadherin与下调Vimentin抑制EMT和伪足形成。     

凋亡相关蛋白死亡受体5、细胞内Fas相关死亡域样白介素1-β转换酶抑制蛋白在胃组织中的表达及临床意义

目的探讨不同胃组织中凋亡相关蛋白死亡受体(DR5)、Fas相关死亡域样白介素1-β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)表达的临床意义。方法检测胃癌、正常胃黏膜及胃炎组织中DR5和c-FLIP蛋白的表达,以及不同分化程度的胃癌组织中的表达差异,对两者进行相关性分析。结果 DR5在胃癌、慢性胃炎、正常胃黏膜中阳性表达率分别为76.67%、53.85%和28.13%;c-FLIP蛋白阳性率分别为85%、30.77%和18.75%,各组比较差异有显著性意义(P<0.05)。DR5蛋白在高、中、低分化腺癌中的表达率分别为38.1%、55%、78.95%,c-FLIP分别为47.62%、70%、94.74%,各组比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论 DR5与c-FLIP蛋白在胃癌中均高表达,两者均参与了胃癌的发生。     

Sonic hedgehog信号通路在胃癌中的研究进展

Shh（Sonichedgehog）作为最重要的Hh同源基因产物,它的异常激活与胃癌的发生、发展关系密切成为近年研究热点。经典的Shh信号通路是由Shh配体、Ptch和Smo组成的受体复合物以及下游转录因子Gli蛋白（Glil、G1i2、Gli3）组成。研究发现相比正常组织,胃癌组织中Shh的表达都有不同程度的升高,且升高程度与胃癌的发展转移呈正相关,本文就Shh信号通路与胃癌的研究进展做一综述。     

二烯丙基二硫与全反式维甲酸合用对HL-60细胞的影响

目的探讨二烯丙基二硫（DADS）与全反式维甲酸（ATRA）联合用药对HL-60细胞生长抑制及诱导分化的影响。方法采用M1Tr、流式细胞术检测细胞周期及生长抑制，用HL-60细胞表面分化抗原CD11b及NBT实验检测HL-60的诱导分化作用。结果DADS与ATRA联合使用可以增加HL-60细胞的生长抑制率，并将HL-60细胞阻滞在G0/G1期。CD11b的表达和NBT实验结果表明两者合用对HL-60细胞的诱导分化作用与任何一种药物单独使用差异无显著性，但当两者剂量各自减少一半时，其诱导分化作用却增加，与任何一种药物单独使用时的诱导分化作用相似。结论DADS与AT—RA联合使用可以协同抑制HL-60细胞的生长，剂量减半合用时可协同对HL-60细胞的诱导分化作用。     

MAPK信号转导通路与肿瘤细胞分化

丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK)信号转导通路是近年来细胞信号转导方面最活跃的研究领域。该通路具有调控肿瘤细胞分化的功能 ,已确定出 4条MAPK信号转导通路 ,其中ERK(P42 /P44MAPK) ,SAPK/JNK ,p38MAPK三条通路与肿瘤细胞分化关系密切。     

大蒜抑制实验性前胃鳞癌及癌前病变的研究

目的　观察大蒜对甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)诱发大鼠前胃鳞癌及癌前病变的影响。方法　MNNG组、预防组、治疗组分别给予MNNG(每天 5ml,含MNNG 1.2 5mg)诱发大鼠前胃鳞癌及癌前病变 ,预防组另给 10 %大蒜匀浆 10ml/d ,10个月后停药。预防组与治疗组继续给大蒜匀浆 ,至 16个月。结果　MNNG组、预防组、治疗组分别诱发大鼠不典型增生 2 4只 (96 .0 % )、16只 (53.3% )和 9只 (4 5.0 % ) ,癌变 15只 (6 0 .0 % )、7只 (2 3.3% )和 4只 (2 0 .0 % )。经统计学处理 ,加用大蒜的预防组、治疗组与MNNG组均有显著性差异(P <0 .0 5)。结论　表明大蒜对MNNG诱发大鼠前胃鳞癌及癌前病变有抑制作用。     

沉默RORα通过Wnt信号通路促进人胃癌细胞增殖与迁移侵袭

目的：在构建沉默RORα人胃癌MGC803细胞的基础上,观察沉默RORα对MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。方法：软琼脂集落形成实验、流式细胞术、细胞迁移和侵袭实验检测RORα沉默对MGC803细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。RT-PCR与Western blot检测RORα、Wnt1、MMP-9与TIMP3 mRNA与蛋白表达。结果：集落形成实验显示,沉默组的集落形成率128.1%明显高于对照组和空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,沉默组S期细胞百分率39.9%较对照组26.1%和空载体组27.4%明显增加(P<0.05)。迁移实验显示,沉默组迁移距离(1.76±0.19) mm明显高于对照组(1.32±0.14) mm和空载体组(1.29±0.17) mm (P<0.05)。侵袭实验显示,沉默组穿膜细胞(172±27)个明显多于对照组(147±17)个和空载体组(149±14)个(P<0.05)。RT-PCR与Western blot表明,沉默RORα可显著上调Wnt1与MMP-9 mRNA与蛋白与下调RORα与TIMP3 mRNA与蛋白。结论：沉默RORα可通过Wnt信号通路上调MMP-9和下调TIMP3促进MGC803细胞增殖与迁移侵袭。     

二烯丙基二硫在RORα抑制人胃癌细胞上皮间质转化中的作用

目的探讨二烯丙基二硫（DADS）是否上调维甲酸相关孤核受体α（RORα）抑制人胃癌细胞株MGC803 细胞上皮- 间质转化（EMT）。方法相差显微镜观察MGC803 细胞形态的改变。逆转录PCR（RTPCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫荧光与免疫组织化学检测EMT 的相关分子表达。裸鼠实验检测DADS 与沉默RORα对移植瘤生长的影响。结果相差显微镜显示,沉默RORα细胞较MGC803 细胞大小与形状差异更明显。DADS作用后,细胞大小较一致,呈圆形或椭圆形,梭形细胞减少,异型性下降。RT-PCR与Western blot显示,DADS 处理后较处理前各组RORα mRNA 与蛋白表达上调（p <0.05）。DADS 作用对照组与空载体组较沉默组效果更为明显（p <0.05）。RORα沉默较对照组和空载体组细胞锌指转录因子（Snail）和波形蛋白（Vimentin）mRNA与蛋白表达上调,而E- 钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA 与蛋白下调（p <0.05）。DADS处理后,各组Snail蛋白下调、Vimentin mRNA与蛋白下调和E-cadherin mRNA与蛋白上调（p <0.05）。免疫荧光显示,沉默组细胞Snail与Vimentin阳性表达较对照组增强,而E-cadherin阳性表达减弱。DADS作用后,结果相反。裸鼠移植瘤实验显示,RORα沉默组移植瘤较对照组生长加快和体重增加（p <0.05）,增殖细胞核抗原（Ki-67）、Snail、CD34及Vimentin 阳性表达较对照组增加,而E-cadherin阳性降低。DADS 处理各组移植瘤生长与体积减慢与减小,Ki-67、Snail、CD34与Vimentin阳性表达较对照组减弱,而E-cadherin阳性表达增强。结论DADS 通过上调RORα 可体内外抑制人胃癌MGC803 细胞EMT。