RNAi对骨肉瘤细胞株HMGA1基因表达及侵袭力抑制的实验研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对骨肉瘤细胞株(MG-63)中HMGA1基因表达和侵袭力的影响.方法:采用单细胞克隆技术,从MG-63中分离培养出高表达HMGAl的骨肉瘤细胞株,将细胞分成3组,通过PU6mRFP载体进行转染:实验组,转染HMGA1的小干扰RNA(siRNA);阴性对照组,转染HMGA1的无关序列;细胞对照组为未转染的MG-63细胞.转染细胞株后,荧光检测转染效率;用实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测siRNA对HM-GA1表达的影响;Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化.结果:荧光检测转染效率,实验组为(55.68±6.74)%,阴性对照组为(49.87±4.33)%;细胞对照组观察不到明显的荧光细胞.实验组HMGA1 siRNA转染骨肉瘤细胞后,明显下调细胞中HMGAl mRNA及蛋白的表达,与转染时间和转染浓度相关;阴性对照组和细胞对照组在转染前后HMGAl基因的mRNA及蛋白质表达均无明显变化.实验组细胞株穿过侵袭膜的细胞数明显低于阴性对照组和细胞对照组,P<0.01.结论:HMGAl siRNA可以下调骨肉瘤细胞中HMGAl mRNA及其蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞侵袭能力.     

重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定

背景：有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP 4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道。 目的：构建重组人BMP-4/7 融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达。 方法：扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序。AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7。用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达。用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3 d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达。 结果与结论：PCR 电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7 基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功。RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P < 0.01)。结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较

背景:有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。目的:观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。方法:经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs7d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。结果与结论:实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P<0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

人工半髋关节置换术治疗高龄患者转子间粉碎性骨折

目的 探讨人工半髋关节置换手术方法治疗高龄患者股骨转子间粉碎性骨折的临床疗效.方法 2004年5月-2007年5月,29例Evans分型Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型患者应用髋后侧或前外侧入路钢丝捆绑复位骨折并行人工半髋关节置换手术,均获得随访.结果 术后随访3～22个月,平均11.5个月.疗效评定:优19例,良10例,优良率100%.术后切口均一期愈合,术前合并内科疾病患者中有2例心血管疾病患者,1例内分泌系统疾病患者病情加重.结论 保留髋关节动力的人工半髋关节置换手术治疗高龄患者股骨转子间粉碎性骨折,具有内固定牢固及病人早期离床活动髋关节动力充足,并有创伤小、操作简易、避免早期并发症等优点.     

兔骨髓基质细胞体外成骨分化鉴定及与煅烧骨复合培养的实验研究

目的研究兔骨髓基质细胞体外向成骨细胞分化的生物学特性及其与牛煅烧骨体外复合培养的生物相容性.方法将体外培养1周的兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化,于1、2、4周时提取RNA,采用RT-PCR技术检测ALP和I型胶原mRNA表达,并对培养2周的细胞行VonKossa染色观察钙结节形成;另制备细胞-煅烧骨复合物,继续培养1、7、14 d后取出,扫描电镜观察及X射线衍射仪检测.结果体外诱导培养2、4周后,兔骨髓基质细胞成功表达ALT和I型胶原,VonKossa染色可见钙结节形成.扫描电镜及X射线衍射分析证实细胞在煅烧骨表面大量贴附成活,14 d后细胞铺满支架表面,合成并分泌胶原纤维及钙盐.结论兔骨髓基质细胞体外可成功向成骨细胞诱导分化,成骨特性表达佳;与牛煅烧骨体外复合培养显示良好的生物相容性.     

椎间撑开颈前路减压植骨钢板内固定术治疗脊髓型颈椎病

[目的]总结并探讨椎间撑开颈前路减压植骨术治疗脊髓型颈椎病的疗效。[方法]自2001年4月~2004年10月,应用CCR颈前路自动拉钩及Caspar椎体间撑开器系统,采用单节段单纯间盘切除、经椎间隙入路或多节段分别间盘切除、椎管潜式扩大减压、植骨、钛板内固定术治疗脊髓型颈椎病68例,随访并复查X线片,测量术前及术后12个月病变椎间隙高度,同时,采用日本矫形外科学会评分标准(JOA)评价手术前后脊髓功能,并统计比较。[结果]全部病例中51例获得随访其中症状明显好转50例,缓解1例,加重0例。术后12个月时,X线片显示全部病例植骨愈合、病变椎间隙骨性融合。同时,手术后病变椎间隙高度保持明显优于手术前,手术后脊髓功能JOA评分亦显著高于术前。本组无颈髓损伤、钢板和螺钉松动及椎前血肿等并发症发生。[结论]椎间撑开颈前路减压植骨钢板内固定术有利于术后颈椎病变椎间隙高度的保持,并可确切恢复、改善脊髓功能。     

应用带腓血管的小腿外侧逆行岛状皮瓣修复足踝部软组织缺损

目的探讨带腓血管的小腿外侧逆行岛状皮瓣修复足踝部软组织缺损的临床应用及其疗效。方法2000-2003年,在对腓血管跨区关系显微解剖加以研究的基础上,应用带腓血管的小腿外侧逆行岛状皮瓣治疗足踝部软组织缺损12例,皮肤缺损面积最大为21 cm×10 cm,最小5 cm×8 cm,切取皮瓣最大24 cm×12 cm。结果术后皮瓣均完全成活,术后的外形平整美观,疗效好。结论带腓血管的小腿外侧逆行岛状皮瓣是修复足踝部软组织缺损的可靠而有效的方法。     

异体双前臂移植四年康复一例报告

目的总结高位双前臂缺失异体移植术后手功能重建及康复的临床效果。方法在应用新型免疫抑制剂及综合抗排斥方案的条件下,采用一体化康复计划,对1例高位双前臂缺失患者术前组织配型、异体移植手术及术后功能康复等治疗,随访4年。结果双前臂、手外形好,感觉基本正常,两点辨别觉2．5～4．0 cm,手指总屈伸度(TAM)均为优良,生活完全自理,心理健康。结论异体双前臂移植术后手功能康复效果满意。