肝细胞与非实质细胞体外共培养的研究进展

近年来,生物人工肝(bioartificial liver,BAL.)支持系统已成为延长急性肝功能衰竭患者生命,并向肝移植手术过渡的一种替代性治疗手段.     

BrdU作为脂肪干细胞标记示踪法的可行性

目的:研究BrdU标记猪脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的最佳剂量及时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:自中华实验猪背部提取脂肪组织,采用贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞以终浓度分别为10、15、20、25及30 μmol/L BrdU进行标记:另一孔不含BrdU作为对照组,分别培养12、24、48、72及96 h.免疫荧光法检测各组细胞BrdU标记率,找出BrdU的最佳标记方法,通过台盼蓝排斥试验、MTT及细胞凋亡检测,观察BrdU对ADSCs生长情况的影响.对第3代的ADSCs采用最佳标记方法后更换普通培养基继续培养,适时传代,连续检测第4、5、6、7、8代ADSCs的BrdU标记率.结果:原代培养的ADSCs的形态主要为长梭形,第3代ADSCs经BrdU标记后胞核呈红色荧光,随浓度的升高及时间的延长,BrdU阳性标记率逐渐升高,以终浓度20μmol/L BrdU标记48 h后阳性率达90%以上,且连续传5代标记率仍达40%.MTT、台盼蓝排斥试验及细胞凋亡检测发现BrdU对ADSCs生长增殖基本无影响.结论:BrdU标记ADSCs的最佳剂量和时间为20 μmol/L和48 h,该方法标记率高,对细胞影响小,可用于动态研究ADSCs在移植体内生长、分化.     

猪肝细胞与骨髓间充质干细胞最适共培养体系的建立

目的：建立猪肝细胞与骨髓间充质干细胞（MSCS）最适宜共培养体系,为生物人工肝的构建提供理想的细胞来源。方法：抽取中华实验猪（n=3）髂前上棘骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;采用原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCS按1∶1,2∶1,5∶1和10∶1的比例混合培养,观察各组共培养肝细胞形态和功能的变化水平。结果：所获肝细胞纯度>99%,存活率>95%。共培养组肝细胞迅速黏附于MSCS表面,在三维空间呈球形聚集生长;肝细胞与MSCS间出现细胞连接,超微结构与正常肝细胞接近。肝细胞/MSCS 以2∶1共培养组的肝细胞清蛋白分泌水平、尿素合成能力和细胞色素P450为各组中之最佳,自第1天培养起均显著高于对照组（P<0.05）,并在第2天达到高峰,而且下降趋势较缓慢。结论：猪肝细胞/MSCS 按2∶1组成的最适共培养体系可最大程度地维持肝细胞功能,为构建功能性生物人工肝提供高效细胞材料。     

膜截流分子量在新型生物人工肝免疫安全性中的作用研究

目的 探讨膜截流分子量对新型生物人工肝(bioartificial liver,BAL)支持系统免疫安全性的影响.方法 应用D氨基半乳糖静脉滴注比格犬建立肝功能衰竭模型.急性肝功能衰竭犬根据BAL隔离膜截流分子量的大小分为两组:A组:200 kD组；B组:1200 kD组.两组均接受新型2次BAL治疗,每次6h.观察各组体内IgG、IgM、50％补体溶血单位(CH50)变化及反应器内抗体漏过情况.结果 在第一次BAL治疗后两组的IgG和IgM水平均没有发生明显的变化.在第2次治疗后第7天,1200 kD组的IgG和IgM水平明显升高,200 kD组IgG和IgM水平仍未出现明显上升或下降.在第一次BAL治疗后,两组CH50都出现暂时性的下降,在治疗后1h达到最低值,而后缓步上升,在7d后恢复至治疗前水平.反应器内培养液中IgG、IgM及CH50检测结果显示,1200 kD组在治疗结束后IgG、IgM及CH50含量显著高于200 kD组.结论 膜截流分子量可能是影响BAL异种免疫排斥的重要因素之一.     

慢加急性肝衰竭病因及其病理生理机制研究进展

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是国内最常见的肝衰竭类型,其临床表现复杂,病死率极高.ACLF的病理生理学改变目前尚不明确,深入了解ACLF的病理生理学改变有助于临床治疗工作的改善.近年来ACLF的病理生理学研究取得了一定的成就.本文就ACLF的概念、病因及其病理生理学改变作一综述.     

组合式生物人工肝治疗犬急性肝功能衰竭

目的 观察新型组合式生物人工肝治疗急性肝功能衰竭犬的作用.方法 D-氨基半乳糖给药构建犬急性肝功能衰竭模型,实验分组:组合式生物人工肝治疗组(n=8);生物人工肝治疗组(n=8);非生物人工肝治疗组(n=8);对照组(n=8).观察和检测所有犬一般情况、生化指标及生存率,同时进行安全性评价.结果 组合式生物人工肝具有良好的解毒及合成功能.4组犬的生存率分别是87.5％、62.5％、50.0％、37.5％,仅组合式生物人工肝组与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05),其余各组差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 组合式生物人工肝对治疗急性肝功能衰竭具有良好的疗效.     

肝移植后慢性移植肝失功的病因诊断和治疗18例

目的:探讨肝移植后慢性移植肝失功的病因诊断和治疗.方法:回顾性分析我院1996-01/2006-12完成的291例原位肝移植中18例肝移植后慢性移植肝失功患者的临床资料,总结肝移植后慢性移植肝失功的病因及诊断和治疗.结果:18例肝移植后慢性移植肝失功患者发生反复胆道感染2例、胆管广泛胆泥2例、胆管吻合口狭窄1例、胆管非吻合口狭窄4例、乙型肝炎复发3例、丙型肝炎复发1例、胆汁性肝硬化1例、肝动脉狭窄1例、巨细胞病毒(CMV)感染1例和慢性排斥反应2例.通过各种内科支持治疗、介入治疗或再次肝移植.11例好转,4例病情反复,3例死亡.结论:根据肝移植后慢性移植肝失功的不同病因,可采取不同的治疗手段;对于不可逆转的移植肝功能衰竭,应进行再次肝移植.     

白介素1受体拮抗剂壳聚糖纳米颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究

目的 探讨炎症因子白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)与骨髓间充质干细胞(MSCs)移植联合治疗肝功能衰竭的协同效应及其机制. 方法 采用静电喷射法制备IL-1Ra壳聚糖纳米颗粒,酶联免疫吸附法测定IL-1Ra纳米颗粒体外缓释作用,荧光显微镜和流式细胞术观察纳米颗粒肝细胞靶向性.将IL-1Ra纳米颗粒与MSCs联合治疗急性肝衰竭(ALF)幼猪,具体方法为:D-氨基半乳糖诱导建立猪ALF模型,34头中华实验小型猪随机分为5组,造模对照组经门静脉注射等渗盐水;IL-1Ra组经门静脉注射等渗盐水6h前耳背大静脉推注IL-1Ra;MSCs组经门静脉移植MSCs;IL-1Ra联合MSCs组和IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs组先由耳背大静脉分别推注IL-1Ra或IL-1Ra纳米缓释颗粒,再经门静脉移植异体MSCs.移植后4周内定期检测肝功能、炎症因子变化和病理改变,并监测移植细胞体内存活、转化和分泌情况.组间数据比较用独立样本t检验.结果 IL-1Ra纳米颗粒在磷酸盐缓冲液中呈现缓慢释放过程;绿色荧光显示乳糖酰基化的纳米颗粒能特异性地靶向到肝细胞.IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs组具有显著炎症环境改善作用,与对照组相比,肿瘤坏死因子α在术后1周即明显下降,而IL-6水平在各时间点均明显降低;且IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs有促进肝功能恢复和肝脏细胞增殖的作用[术后第3周,每个200倍视野下的细胞数为(68.8±9.1)个,与对照组的(21.2±2.5)个相比,t=5.173,P＜0.01];免疫组织化学及荧光显微镜显示该组MSCs存活数量明显增多;Western blot结果显示该组分泌肝细胞生长因子及血管内皮生长因子较其余各组明显增多.结论 IL-1Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒具有良好的肝脏靶向和药物缓释作用,联合MSCs移植具有明显协同作用,通过改善炎症环境和分泌多种细胞因子显著改善D-氨基半乳糖诱导的ALF动物的肝功能指标,促进肝组织再生.     

生物人工肝中细胞材料的研究进展

急性肝功能衰竭是一类死亡率极高的综合症候群.近年来,虽然临床治疗手段不断改进,死亡率仍然高达50%～80%,暴发性肝功能衰竭者甚至町达90%以上[1].     

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目的 探讨术中肠镜对小肠血管畸形的诊治价值.方法 回顾性分析2003年1月至2005年1月南京大学医学院附属鼓楼医院收治并手术确诊的17例小肠血管畸形的临床资料.结果 17例病人均以反复黑便或血便等消化道出血为主要临床表现;术前均经胃镜检查排除胃十二指肠出血;结肠镜检查排除下消化道(结肠及直肠)出血;术前均行胶囊内镜检查,其中诊断小肠血管畸形10例(10/17),不能明确诊断或漏诊7例(7/17).17例病人均行剖腹探查,术中肠镜检查发现点状或片状黏膜血管扩张或出血点,分布于整个小肠,病变最多达18处,最少2处.行点状切除1例,点状+楔形切除7例,点状+肠段切除4例,楔形切除3例,肠段切除2例.手术切除标本行病理检查均证实为小肠血管畸形.17例病人随访2～4年,平均33个月,无一例发生再出血.结论 术中肠镜检查对小肠血管畸形具有重要价值,可对小肠血管畸形做出准确定性诊断,是诊治小肠血管畸形的主要手段.