RNA干扰对肾癌细胞系MDR1基因表达的抑制

1 方法 1.1 siRNA的设计和合成根据多药耐药基因1(MDR1)已知序列(NM 000927),设计3条sLRNA序列(分别为siRNAl、mR-NA2、siRNA3),另设随机序列作为阴性对照,根据每条siRNA序列构建对应的DNA模板单链,模板链两端分别添加BamH Ⅰ和EcaR Ⅰ酶切位点.     

化疗诱导Egr-1启动子调控造血因子基因表达的实验研究

目的探索化疗药物诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达对化疗后造血损伤的恢复作用。方法将GM-CSF和EGFP双顺反子基因重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo真核表达载体,构建Egr-EG载体,通过脂质体介导转染骨髓基质细胞HF-CL,即获得HFCL/EG细胞。MTT法测定顺铂（DDP）、氟尿嘧啶（5-FU）、吉西他滨（GEM）和紫杉醇（PTX）对HFCL和HFCL/EG细胞存活率的影响,并计算各药物对细胞的IC50值。倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测化疗药物诱导后绿色荧光蛋白（EGFP）表达阳性的HFCL/EG细胞百分率。ELISA法检测活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对化疗药物诱导的Egr-1启动子调控的下游GM-CSF基因表达的影响。观察化疗诱导后HFCL/EG上清对粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）的影响。结果成功构建了Egr-Eg载体,其转染细胞HFCL/EG细胞对DDP、5-FU、GEM和PTX有不同的敏感性,且药物对HFCL/EG细胞IC50值均较HFCL组明显增加（P〈0.05）。流式细胞仪检测显示DDP、5-FU、GEM和PTX均可以诱导调控Egr-1启动子调控的EGFP表达,HFCL/EG＋DDP组、HFCL/EG＋5-FU组、HFCL/EG＋GEM组、HECL/EG＋PTX组绿色荧光阳性的细胞百分率分别为35.06%±0.61%、65.12%±1.10%、44.47%±0.71%、37.56%±0.63%,与HFCL/EG组（10.02%±0.21%）相比明显增加（P〈0.05）。化疗药物处理后,HFCL/EG细胞培养上清液中,GM-CSF含量和CFU-GM形成数量较未化疗组明显增高（P〈0.05）；但加入活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸后,培养上清中GM-CSF含量明显减少（P〈0.05）。结论化疗药物诱导的Egr-1启动子调控下游基因表达与活性氧相关,且Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对化疗后的造血损伤具有一定的保护作用。     

辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.     

营养性贫血患者十二指肠降部粘膜组织学和超微结构观察

采用常规胃镜下十二指肠降部粘膜活检，对降部粘膜绒毛组织学及微绒毛超微结构进行观察并行相应图像定量分析。营养性贫血组２１例，包括９例巨幼细胞贫血，１２例缺铁性贫血，其中６例行电镜观察。对照组２６例，其中１１例行电镜观察。结果，营养性贫血组绒毛长度显著缩短（Ｐ＜０．０１），绒毛宽度显著增宽（Ｐ＜０．０１），隐窝深度明显加深（Ｐ＜０．０１），本组多有不同程度的萎缩，中、重度萎缩占１４／２１（χ￣２＝６．０１，Ｐ＜０．０５）。组织学观察还可见不同程度的绒毛融合、扭曲和消失，核增大，粘膜下炎性细胞浸润。其中７例贫血纠正后复查十二指肠降部，粘膜活检表明粘膜萎缩和炎症程度明显减轻（Ｐ＜０．０１）。超微结构及图像定量观察表明微绒毛密度稀疏（Ｐ＜０．０１）、高度减低（Ｐ＜０．０１），表面积缩小（Ｐ＜０．０１），其它可见微绒毛长短不一、排列不齐、融合及萎缩、核变大。结果揭示了从绒毛到微绒毛的一系列改变，表明营养性贫血可以引起吸收不良的病理改变，纠正贫血后这种改变是可以恢复的。     

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo~R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.     

辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.     

半抗原DNP修饰自体肿瘤疫苗治疗恶性黑素瘤

目的:探讨半抗原二硝基氟苯(dinitrophenyl,DNP)修饰自体肿瘤疫苗治疗恶性黑色素瘤的疗效。方法:32例Ⅲ期恶性黑素瘤(恶黑)患者,肿瘤或淋巴结切除后,分别采用半抗原DNP修饰的自体瘤苗和未修饰自体瘤苗联合生物化疗进行治疗,观察两组患者淋巴细胞亚群变化、迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)和临床随访。结果:①两组比较,半抗原修饰瘤苗组较未修饰疫苗组CD8~ -IFN-PE明显升高(P<0.05);半抗原修饰瘤疫苗组治疗后CD8~ -IFN-PE细胞比例较治疗前明显升高(P<0.05),然而,半抗原未修饰瘤苗组治疗前后变化不大(P>0.05)。②半抗原修饰瘤苗组患者治疗后DTH明显增强,硬结由(5.4±1.2)mm增大到(23.5±4.2)mm(P<0.05),半抗原未修饰瘤苗组硬结由(6.3±1.4) mm增大到(11.2±3.2)mm(P<0.05),然而,两组DTH达到阳性结果(≥5mm)的百分比分别为95%和36%(P<0.01)。③随访2年,半抗原修饰瘤苗组13例患者生存时间超过24个月,其中仅2例DTH阴性;半抗原未修饰瘤苗组8例患者生存时间超过24个月,6例DTH阳性。结论:半抗原DNP修饰的自体肿瘤疫苗可增强恶性黑素瘤患者特异性细胞介导的免疫反应,从而延长患者生存时间。     

化疗诱导Egr-1启动子调控的GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血损伤的作用

背景与目的: 电离辐射可以通过产生活性氧激活Egr-1启动子高度保守序列CArG,Egr-EG为构建的上游含Egr-1调控序列CArG元件,启动TNF或GM-CSF的pCIneo表达载体,该机制可用于辐射所致的造血损伤或治疗肿瘤.化疗药物通常是通过产生活性氧和DNA损伤导致肿瘤细胞死亡,我们假设化疗药物可以产生活性氧.因此,化疗可以诱导Egr-1启动子调控下游造血因子基因表达,这种化疗诱导基因疗法针对化疗所致的造血损伤具有恰当的治疗效果.本文旨在探讨化疗诱导Egr-1启动子调控的造血因子基因表达对化疗后造血恢复的作用.方法: 将构建的携带有早期生长因子(Egr-1)启动子的GM-CSFcDNA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入荷瘤(黑色素瘤)小鼠体内,对其实施5-FU化疗,观察外周血象动态改变、人基质细胞植入检测、外源基因eGFP、GM-CSFmRNA、蛋白表达以及对CFU-GM的增殖作用的检测.结果: 实验组与对照组相比外周血白细胞下降幅度明显减轻,恢复加快,而各组问CFU-GM差异无显著性.肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达无关:5-FU处理后72 h实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞,RT-PCR和Western印迹显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.结论: 5-FU诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法对化疗后造血损伤具有促进造血恢复作用.