用两次标记法观察抗放药对照射小鼠幼粒细胞周期的影响

我们过去曾用~3HTdR标记放射自显影方法,作了几类抗放药物对小鼠幼粒细胞成熟释放动力学影响的观察。为了进一步了解这些抗放有效药物对小鼠骨髓粒系增殖动力学的影响,我们采用了~3H胸腺嘧啶核苷两次标记法,作了这方面的研究     

阻断CD40/CD40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间

目的：克隆表达人CD40-Ig融合蛋白，并在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中研究利用其阻断CD40/CD40L相互作用的保护性效果。方法：利用RT-PCR技术自人Daudi细胞系中克隆CD40基因胞外区，并插入含有人IgG1Fc段基因的pIG1载体中，构建携带CD40-Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS-7细胞，间接夹心ELISA法检测CD40-Ig融合蛋白的表达，再将CD4-Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞，筛选分泌CD40-Ig融合蛋白的阳性重组CHO细胞并进行无血清大规模培养，收获培养上清利用ProteinA亲和层析法纯化融合蛋白。SDS-PAGE，Western blot和配基结合实验鉴定CD40-Ig的性质，将C57BL6/J（H-2^b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H-2^d)小鼠体内建立急性GVHD模型。通过体内注射CD40-Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果。结果：按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/40Ig和p3.1/40Ig。ELISA和Western blot确定在COS-7和CHO细胞中表达了CO40-Ig融合蛋白，SDS-PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在，纯化的CD40-Ig可与CD40L结合，体内应用CD40-Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间。结论：CD40/CD40L相互作用在GVHD的病理过程中可能扮演了十分重要的角色，提示人CD40-Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用潜力。     

逆转录病毒介导的IL6/IL2融合基因转导对小鼠B16细胞粘附及转移特性的影响

为探讨细胞因子之间对肿瘤细胞修饰的协同效果及融合基因用于肿瘤细胞转染的可行性,我们采用PCR及柔性接头连接的方法,构建了含人IL6/IL2融合基因的逆转录病毒载体,将其转染小鼠B16黑色素瘤细胞,对基因转导后细胞的粘附及实验性肺转移能力进行了测定.实验结果表明,融合基因转导的细胞所分泌产生的融合蛋白具有IL-2和IL-6两种细胞因子活性.对肿瘤细胞体外粘附及转移能力的测定结果表明,经融合基因修饰的B16细胞对细胞外基质的主要成分Laminin及重组基底膜Matrigel的粘附得到抑制,同时伴有实验性转移能力降低.这一结果提示,融合基因转导可明显降低肿瘤细胞的转移能力,其机制可能与基因修饰细胞相关生物学特性的改变及其对机体的免疫刺激活性有关.     

EFFECTS OF IL-6/IL-2 FUSION GENE TRANSFECTION ON TUMOUR CELL BIOLOGICAL CHARACTERISTICS IN VITRO AND IN VIVO

ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＩＬ６／ＩＬ２ＦＵＳＩＯＮＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮＯＮＴＵＭＯＵＲＣＥＬＬＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＩＮＶＩＴＲＯＡＮＤＩＮＶＩＶＯＹｕＸｉａｏｄａｎ于晓ＴａｎｇＰｅｉｘｉａｎ唐佩弦ＺｈａｏＣｈ...     

MHC Ⅱ类基因瘤体内直接注射治疗小鼠肿瘤的研究

目的:许多基因治疗方案可以诱导产生抗肿瘤免疫反应,但是ex vivo的操作方式限制了其应用.本研究采用瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因的方法来诱导抗肿瘤免疫反应.方法:针对具有弱免疫原性的小鼠肥大细胞瘤P815和非免疫原性的小鼠黑色素瘤B16,在瘤体的原位注射MHC Ⅱ类基因,观察肿瘤的生长情况.结果:直接注射MHC Ⅱ类基因,使P815肿瘤的致瘤性明显下降,并且对第二次接种P815细胞具有抵抗能力;虽然对B16而言,仅注射MHC Ⅱ类基因无治疗效果,但与B7基因共同注射,却能够显著地抑制B16肿瘤的生长.结论:瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因可以用来进行肿瘤治疗.     

IL－2和IL－6融合蛋白的分子生物学特性的研究

本文应用酶联免疫吸附技术对ＩＬ－６／２融合蛋白（ＦＰＩＬ－６／２）进行了定性、定量分析，测定其等电点，并对该蛋白的表位、柔性和抗原性进行了计算机模拟。ＥＬＩＳＡ测试结果表明：融合蛋白ＩＬ－６／２含有ＩＬ－２和ＩＬ－６两个结构域，可分别与ＩＬ－２和ＩＬ－６单克隆抗体结合，且两个结合无明显空间排阻效应，这与计算机的表位、柔性和抗原性分析结果一致。从计算机模拟也可以看出ＦＰＩＬ－６／２的抗原性与ＩＬ－２和ＩＬ－６的一致性，而且接头区抗原性较低，这为该蛋白的实际临床应用提供了一定的保证。     

人可溶型IL－4受体在大肠杆菌中的基因克隆与表达

利用ＰＣＲ技术从ＴＦＩ细胞中克隆和扩增人ＩＬ－４ＲｃＤＮＡ胞外片段。经ＤＮＡ测序证实后，定向插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０中，井获得了高效表达。表达蛋白经纯化和复性后具有ＩＬ－４结合活性。     

我国造血干细胞基础研究的新进展兼论干细胞可塑性

1995年以来我国造血干细胞工程与相关的生物学领域的研究发展迅速。有关造血干 祖细胞基因表达的研究 ,上海国家人类基因组研究中心陈竺、陈赛娟等为正常和急性白血病人骨髓造血干祖细胞cDNA文库的基因表达建立了一套先进的工作体系。他们在许多白血病细胞系的干 祖细胞中发现了 30 0个新的相关基因。中山大学医学院李树浓、黄绍良等从人的桑葚期胚胎干细胞成功地诱导出造血细胞等。北京输血研究所裴雪涛等从成人和胎儿的骨髓分离出成年源干细胞 ,又进一步诱导分化为骨、软骨、脂肪和神经原细胞等。他们成功地构建了胎儿和成人间充质干细胞cDNA扣除文库 ,获得了胎儿和成人间充质干细胞的差异表达基因及在胎儿特异表达基因。中国医学科学院天津血液学研究所、国家血液学重点实验室赵春华等证实从胚胎胰腺、骨髓和肝脏中都可以分离出人间充质干细胞 ,又证明G CSF可以使输注的间充质干细胞在体内促造血重建。北京基础医学研究所毛宁等的实验不支持间充质干细胞可以“横向分化”。最近他们发现小鼠胚胎干细胞的体外分化重现了胚胎早期造血发生的生物学程序以及Smad5基因调控在胚胎造血发生中的必要性和多样性 ,又表明其上游配体TGF beta家族分子在胚胎发生中的作用和特点。本文针对干细胞可塑性研究作了评     

TGF-β1,反义c-myc和反义bcr/abl基因转导诱发细胞凋亡的电镜观察(英文)

程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是一主动性细胞“自杀”过程,是细胞内部基因引导的一系列精密生化级联反应的结果。凋亡(apoptosis)是PCD的形态学指征,探讨何种基因并以何种途径诱发PCD是当前研究的热点,也是本研究的动机。基因转导是从分子水平研究基因调控的一种手段。本研究采用基因转导法结合电镜观察细胞凋亡,选择的目的基因分别是构建在真核表达载体pMAMneo中人TGF-β1cDNA基因全长,采用磷酸钙共沉淀法,体外转染贴壁生长的人肺巨细胞癌PLA-801D株细胞,以及构建在逆转录病毒载体pDORneo中的反义c-myc、反义bcr/abl基因片段,采用Lipofectin体外转染悬浮培养的人白血病HL-60或K562细胞,除进行一系列分子细胞生物学指标的检测外,重点对转染后不同阶段细胞进行了透射电镜观察。结果发现转染TGF-β1的人肺癌细胞多呈现典型的“凋亡”改变;核异染质凝聚呈“半月形”、细胞出芽(budding),形成大量“凋亡小体”,胞浆细胞器尚完好,凋亡小体内亦见完整压扁的细胞器,并可见吞噬有染色质凝块的癌细胞,而转染反义c-myc,反义bcr/abl的HL-60或K562细胞更多出现核“新月体”,亦见“球形”、“面包圈”状凝聚异染质,并见吞噬“凋亡小体”现象。转染TGF-β1细胞DNA电泳呈现的“DNA梯带”更进一步证实上述     

间充质干细胞来源的成骨细胞具有免疫调控能力

为了探讨来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的成骨细胞的免疫调控能力，将MSC在成骨诱导体系中诱导分化1周后用MTT法检测细胞生长变化，流式细胞术鉴定其免疫表型改变，淋巴母细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明，MSC在向成骨诱导过程中细胞生长迅速，明显快于未诱导的MSC，细胞表型未发生明显变化，即CD73，CD105，CD44，CD29等仍为强阳性，而造血细胞的表面标志CD34，CD45和参与免疫反应的细胞表面分子HLA—DR，CD86等仍为阴性。淋巴母细胞转化实验结果显示，源于MSC的成骨细胞具有免疫调控能力，且随着成骨细胞量的增多，抑制T细胞增殖能力越强。结论：MSC来源的成骨细胞具有免疫调控能力。