IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略

目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略.鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等.将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定.IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测.     

新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部分表征的鉴定

目的：对构建的新型重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定。方法：采用SDS-PAGE相对分子量、胰蛋白酶消化的MALDI-TOF-MS质谱、蛋白印迹、全波长扫描和MTT法分别测定该融合蛋白相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果：B7-2-PE40KDEL经12%SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对分子量为72628,与理论预测值69561相比误差在5%之内;全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225nm和276nm处各有一吸收峰;MALTI-TOF-MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为60000～80000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合蛋白为全新蛋白,与我们预测的目的蛋白相符;Westernblot实验显示B7-2-PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT杀伤活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28^＋的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤,而对不表达的CD28^-淋巴细胞系Raji无任何杀伤。结论：重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7：CD28细胞杀伤活性的蛋白质。     

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析

为了对构建成功的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定，采用Edman法、SDS-PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI—TOF—MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N-末端6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明：所构建表达纯化的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白N末端6个氨基酸序列为Met—lie—Asp—Lys—Gin—Ile-，而IL-6缺失24个氨基酸后的原序列为Ile—Asp—Lys—Gin—Ile-，由于采用了大肠杆菌表达系统，因此在N末端第1位多出了1个Met，经12％SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算，其相对分子量为58．75kD，与理论值56．9kD相比误差在5％之内。MALTI—TOF—MS质谱测定共获得10个与理论预测值相符的肽段，经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明，在分子量为57kD左右的范围内未检索到与上述务件相符的已知蛋白，证明本融合蛋白为全新蛋白，与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白能与IL-6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达IL-6R的多发性骨髓瘤细胞系U266产生特异性杀伤，而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论：所研制成功的重组IL6D24-PE40KDL外毒素融合蛋白的确为一全新的具有靶向杀伤生物活性的蛋白质，与设计的完全一致，同时也证实了构建策略的可行性。     

低分辨率和高分辨率HLA-Ⅱ类PCR-SSP基因分型在骨髓移植中的应用

为满足临床骨髓移植对HLA配型的要求,本研究采用先进、快速的DNA提取方法和低分辨率与高分辨率HLA-ⅡPCR-SSP分型方法,对150例临床骨髓移植供、受者进行HLA-Ⅱ类分型研究,并且对分型方法进行了改进,建立了随时间释放DNA聚合酶活性的分型方法。结果表明:DNA提取方法可以满足微量HLA-Ⅱ类DNA分型方法对DNA样本的要求,200μl全血DNA产量为4-12μg,A_(260)/A_(280)为1.7～1.9。低分辨率和高分辨率HLA-Ⅱ类PCR-SSP均具有良好稳定性、可靠性和准确性。低分辨率HLA-Ⅱ类PCR-SSP方法耗时1.5小时,适用于同胞兄弟姐妹间的骨髓移植配型。高分辨率HLA-Ⅱ类亚型PCR-SSP分型方法耗时2小时50分钟,适用于同胞兄弟姐妹间骨髓移植配型的特殊病例和无血缘关系骨髓移植供、受者间的配型。本研究的分型方法对于推动我国骨髓移植工作的开展和未来的发展均具有重要的意义。     

白细胞介素6受体的β亚单位基因和蛋白人白血病细胞中的表达

胞因子-受体系统介导的靶向杀伤作为新一代导向治疗策略的创立已经引起临床血液学及肿瘤治疗学研究者的极大关注[1].我们先前的动物实验结果业已证明,重组白细胞介素6(IL-6)-PE40外毒素融合蛋白能高度特异性地杀伤高表达人IL-6受体(IL-6R)的BNML大鼠急性早幼粒细胞白血病细胞,明显延长白血病大鼠的生存期,而对正常造血细胞无不良反应[2,3].新近我们的研究结果则显示,粒、单、红白血病细胞不但高表达IL-6Rα亚单位的基因和蛋白,而且还高表达高亲和力IL-6R.鉴于IL-6R的β亚单位在高亲和力IL-6R形成中所发挥的关键性作用[4,5],因此从理论上讲,白血病细胞表面高亲和力IL-6R的多寡与重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病的生物学效应密切相关[6].所以,全面系统地阐明人类白血病细胞是否表达IL-6R的β亚单位基因和蛋白具有十分重要的临床指导意义.我们首次采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术并结合流式细胞术(FACS)对IL-6R的β亚单位mRNA和蛋白在8种极具代表性的人类白血病细胞系U937、HL-60、KG1、TF1、K562、HuT 28、CEM及Raji中的表达进行了深入的探索.