构建及鉴定TACO特异性10-23DRz表达载体重组耻垢分枝杆菌

目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DZ)的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

Abstract：

Objective To construct a recombinant bacterial vaccine which can express specific 10-23 deoxyribozyme(DZ) in macrophage, identify the intracellular production of specific 10-23DZ and detect the activity of this recombinant bacterial vaccine on inhibiting the expression of TACO gene in macrophage.Methods The pSDE02 was obtained by inserting the replicon of Mycobacterium into pSDE01, a plasmid which can express 10-23DZ in eukaryotic cells. The expression sequence of DZ1, a 10-23DZ targeting the TACO mRNA of macrophage designed in our previous study was synthesized and inserted into pSDE02. The resulted plasmid was named pDZM01. pDZM01 was then transferred into Mycobacterium smegmatis by electroperation. The recombinant M. smegmatis, named rMs-DZ1 was screened on low-salt LB medium containing Zeocin and identified by Colony PCR. The targeted delivery property of recombinant M. smegmatis was observed by Ziehl-Heelson stain and GFP expression observation via fluorescence microscope. rMs-DZ1 was used to infect RAW264.7 cells and the expression of DZ1 in macrophage was identified by dot-blot assay. At 24 h and 48 h after infection, total RNA and proteins were extracted and the TACO mRNA and protein expression level was assayed by RT-PCR and western-blot respectively. Results Restrictive analysis and sequencing data showed that the Mycobacterium-eukaryotic cell shuttle plasmid pSDE02 and pDZM01 was successfully constructed. rMs-DZ1 was confirmed by colony PCR. When engulfed by macrophage, rMs-DZ1 would express DZ1 in RAW264.7 cells and inhibit the expression of taco gene. When compared to uninfected macrophage, rMs-DZ1 significantly reduced the taco mRNA by 67.90% and 57.14% and down-regulated the expression of TACO protein by 53.85% and 68.92% at 24 h and 48 h respectively. Conclusion A recombinant M. smegmatis vaccine was successfully constructed which could generate specific 10-23DZ in macrophage and inhibit the expression of target gene of interest. To our knowledge, this is the first bacterial vector which can express intracellularly 10-23DRz in targeted manner. This study may further prompt the feasibility of using 10-23 DNAzyme to achieve effective and targeted gene silence.     

腺苷脱氨酶对结核性脑膜炎诊断价值的Meta分析

目的 探讨脑脊液腺苷脱氨酶(ADA)检测在结核性脑膜炎(TBM)中的诊断价值.方法 检索1990年1月-2010年10月Cochrane图书馆、PubMed和万方数据库等数据库,按照Cochrane协作网推荐的诊断试验纳入标准筛选文献,采用QUADAS工具评价纳入文献质量,应用Meta-Disc 1.4软件对纳入研究进行综合定量评价并绘制综合受试者工作曲线(SROC).结果 共检索到相关文献149篇,排除134篇,符合纳入标准的15篇进入Meta分析,涉及研究对象1 642例.异质性检验提示存在异质性,按随机效应模型进行Meta分析,ADA诊断TBM的敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、诊断优势比的汇总值分别为0.73[95%CI(0.70,0.76)]、0.90[95%CI(0.88,0.91)]、7.79[95%CI(4.80,12.63)]、0.25[95%CI(0.17,0.35)]和36.01[95%CI(16.08,80.66)]SROC下面积AUC为0.8856(Se=0.0412),Q值为0.8162.结论 脑脊液ADA对TBM的临床诊断价值有较低的敏感度和较高的特异度,测定脑脊液ADA可作为诊断TBM的辅助诊断指标.     

巨噬细胞极化及其在感染性疾病中的作用

巨噬细胞作为重要的固有免疫细胞和抗原提呈细胞,在机体抗感染免疫中发挥着重要作用.在不同的微环境下,巨噬细胞可发生表型和功能极化从而呈现出不同的功能,一般将经典途径和替代途径活化的巨噬细胞(M1型和M2型)作为巨噬细胞功能可塑性调变的两个极端.随着研究的深入,巨噬细胞极化类型的诱导及特点也逐渐被揭示,其在微生物感染免疫中的作用日益受到重视.     

显微镜观察药物敏感度检测技术在结核病早期诊断中的应用

目的 利用显微镜观察药物敏感度检测技术(MODS)直接检测痰标本中结核分枝杆菌(MTU),评价其在结核病快速诊断中的应用价值.方法 收集264份肺结核临床疑似患者的痰标本和20份非结核病患者痰标本,分别采用抗酸染色法、罗氏培养基(L-J)培养法和MODS技术进行MTU检测,观察3种方法对痰标本中MTU的检出情况;对抗酸染色法和L-J培养法检测均为阴性的肺结核临床疑似患者进行为期90 d的临床随访,由专科医师在此基础上作出临床诊断,再以临床诊断为标准,对比分析3种方法的检测性能,评价MODS技术的临床应用价值.结果 3种方法检测20份非结核病患者痰标本结果均阴性;在264份肺结核临床疑似患者的痰标本中,抗酸染色法、L-J培养法和MODS技术的阳性检出率分别为28.8％、36.0％、42.8％,其中在102份抗酸染色和(或)L-J培养阳性的痰标本中,MODS检出97份(95.1％),在162份抗酸染色和L-J培养均为阴性的标本中,MODS阳性16份;若以临床诊断为标准,MODS、L-J培养法及抗酸染色法的敏感度和特异度分别为63.4％和97.8％、54.3％和100.0％、43.3％和100.0％,三者敏感性差异有统计学意义(P＜0.01);MODS的阳性检出中位时间为10d,明显短于L-J培养的25 d.结论 MODS技术与传统病原学检测方法相比,具有敏感性好、检出时间短的优势,适用于结核病的临床快速诊断.     

系统性红斑狼疮患者外周血NK细胞TIM-3表达和意义

目的探讨TIM-3在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血NK细胞上的表达及临床意义,以阐明其在SLE发生和发展中的作用。方法应用流式细胞仪检测44例SLE患者和34例健康对照者外周血NK细胞表面TIM-3表达水平,比较SLE组和健康对照组之间NK细胞表面TIM-3表达水平,并分析其与实验室检查数据及治疗的相关性。2组间比较采用t检验、配对t检验或者非参数检验,两变量之间相关性采用Pearson相关分析。结果 1)SLE患者NK细胞TIM-3表达的平均荧光强度(MFI)显著高于健康对照组(P=0.033);SLE患者NK细胞TIM-3表达百分率显著高于健康对照组(P0.001)。2)SLE患者外周血NK细胞上TIM-3表达的MFI与C3、C4呈负相关(r=0.32,P=0.037;r=0.30,P=0.049);SLE患者外周血TIM-3+NK细胞百分率与单核细胞数量呈负相关(r=0.32,P=0.033)。3)抗ds-DNA抗体阳性的SLE患者NK细胞TIM-3表达的MFI显著高于抗ds-DNA抗体阴性的SLE患者(P=0.050);SLE患者外周血TIM-3+NK细胞百分率与抗ds-DNA抗体浓度呈正相关(r=0.30,P=0.049)。4)低血小板血症组SLE患者外周血NK细胞上TIM-3表达的MFI显著高于阴性者(P=0.045)。5)治疗后SLE患者NK细胞TIM-3表达的MFI和TIM-3+NK细胞百分率都明显降低(均P=0.009)。结论 SLE患者外周血NK细胞TIM-3表达异常,与及疾病的严重程度有明确的相关性。     

显微镜观察药物敏感性试验在结核性淋巴结炎中的应用评价

摘要：目的：探讨显微镜观察药物敏感性试验（MODS）用于结核性淋巴结炎的诊断价值及直接进行结核分枝杆菌（MTB）耐药性检测的可能性。 方法：对94例细针针吸细胞学（FNAC）诊断为结核性淋巴结炎患者,用MODS法、抗酸染色和改良罗氏培养基培养（以下简称罗氏法）对穿刺吸出物进行MTB检测;抗酸染色阳性标本同时用MODS法和绝对浓度法检测药敏,对两法检测结果不符的菌株进行最低抑菌浓度（MIC）测定。 结果：MODS法、罗氏法和抗酸染色法检测结核性淋巴结炎的阳性率分别为51.1%、39.4%和22.3%,MODS法阳性率均显著高于罗氏法和抗酸染色法（χ² =7.69与25.04,P均＜0.01）。MODS法和罗氏法检测结果的符合率为86.2%。MODS检测时间中位数为13 d,明显短于罗氏培养法的29 d。MODS检测21株MTB对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素药敏结果与罗氏药敏结果符合率分别为95.0%、85.7%、85.7%、100%。7个MODS药敏结果与罗氏药敏检测结果不符,经MIC检测5个药敏结果支持MODS法结果。 结论：MODS技术对结核性淋巴结炎诊断和MTB药敏试验检测有较高的敏感性和准确性,在结核病防控中有较好的应用价值。     

系统性红斑狼疮患者外周血中性粒细胞PD-L1表达和临床意义

目的 探讨程序性死亡配体1(PD-L1)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中性粒细胞上的表达及临床意义.方法 应用流式细胞仪检测77例SLE患者和43例健康对照者外周血中性粒细胞表面PD-L1表达百分率,比较SLE组和对照组之间以及SLE活动组和稳定组中性粒细胞表面PD-L1表达百分率,分析其与SLE临床表现及实验室检查指标的相关性,并检测10例SLE患者治疗前后中性粒细胞PD-L1的表达.结果 ① SLE组外周血PD-L1+中性粒细胞百分率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.000 1);活动组PD-L1+中性粒细胞百分率高于稳定组,差异有统计学意义(P=0.002 7).② SLE患者PD-L1+中性粒细胞百分率与SLE疾病活动性评分(SLEDAI)、抗核抗体(ANA)、免疫球蛋白G(IgG)、红细胞沉降率(ESR)呈正相关性,与红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)浓度、红细胞压积(HCT)呈负相关性,对这些呈线性相关的变量进行线性回归分析显示SLE患者PD-L1+中性粒细胞百分率与ANA和ESR的线性回归差异有统计学意义(P=0.020、0.005).以外,在低补体3(C3)组和低白细胞计数(WBC)组中,SLE患者PD-L1+中性粒细胞百分率与C3、WBC呈负相关性.SLE患者中低WBC、低血小板计数(PLT)、高中性粒细胞数、高中性粒细胞百分比阳性组PD-L1+中性粒细胞百分率均高于对应的阴性组,差异均有统计学意义(P<0.05).③ SLE患者发热、皮肤表现、低白细胞血症、低红细胞血症、低血小板血症、贫血和血尿阳性组PD-L1+中性粒细胞百分率均高于对应的阴性组,且差异均有统计学意义(P<0.05).④ SLE患者有效治疗后PD-L1+中性粒细胞百分率降低(P<0.01).结论 SLE患者外周血中性粒细胞表面PD-L1表达异常,与疾病的活动性和严重程度以及抗体产生有关.     

MODS技术的研究和应用进展

早期发现和诊断结核病(Tuberculosis,TB)病人、及时选用敏感药物给予有效治疗,是减少TB传播机会、控制TB疫情的关键环节。目前,病原学诊断仍是TB诊断的金标准,也是判断疾病活动性、传染性和疗效考核的主要指标。传统的TB病原学检查主要是涂片抗酸染色检查和罗氏培养基培养法(L-J法)。抗酸染色的优点是操作简单,快速,但敏