多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

目的 建立多重实时PCR检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法 优化多重实时PCR反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株，并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10^1拷贝／pJ的毒力基因和10。CFU／p．1的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100％。粪便样品的DNA提取以BP肉汤增菌6h后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae阳性，均鉴定为大肠埃希菌。结论 建立的同时检测stx1、stx2、eae基因的多重实时PCR方法，具有较高的敏感性，可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征

目的 研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因EstB2杂合型的分子特征.方法 采集杭州市自然种群库蚊,提取单蚊DNA基因组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法进行抗性相关酯酶的基因分型.对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物,进一步选用Bfm Ⅰ内切酶进行酶切,确定酯酶B2基因Estβ2纯合犁及Estβ2杂合型.本次研究共提取207只单蚊DNA,156份PCR样本阳性,阳性率75.36%(156/207).结果 在156份PCR样本阳性,酯酶B2基因Estβ2型占28.20%(44/156);对该基因型进一步分型,其中Estβ2纯合型占90.90%(30/33),EstB2杂合型占9%(3/33);Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合(Estβ2/Estβ2<'1>)形式存在.结论 建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法,研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型.     

实时荧光PCR检测肠产毒性大肠埃希菌耐热肠毒素基因

目的：建立实时荧光PCR的方法检测肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）耐热肠毒素（ST Ia和ST Ib）基因。方法：设计引物和探针,优化实时荧光PCR检测STIa和STIb基因的反应条件。检测ST阳性或阴性的20株大肠埃希菌和2株霍乱弧菌以评估方法的特异性。对90份腹泻病人肛拭子标本,经BP增菌4 h后以煮沸法提取DNA模板,直接检测STIa和STIb基因,阳性标本以普通PCR检测ST基因进行复核,并从阳性的初始肛拭子标本中分离鉴定携带ST的菌株。结果：实时荧光PCR具有较高的特异性。90份腹泻病人标本中,9份标本ST Ib基因阳性（10.0%）,2份标本为ST Ia基因阳性（2.2%）;阳性标本以普通PCR复核,符合率为100%。在9份STIb基因阳性和2份ST Ia基因阳性的初始肛拭子标本中,分别有8份和2份分离到STIb基因阳性的ETEC和STIa阳性的ETEC。结论：建立的实时荧光PCR方法,可用于ETEC菌株ST毒力基因鉴定和临床腹泻粪便标本的直接快速筛检。     

PCR法快速鉴定啤酒中分离的乳酸杆菌

目的：建立一种灵敏、快速的PCR法检测啤酒中的乳酸杆菌。方法：设计一对属特异性引物扩增乳酸杆菌的16SrDNA基因，对7株乳酸杆菌进行检测，扩增片断长度为223bp，金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、李斯特菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、铜绿假单孢菌5种菌作为阴性对照菌。结果：该引物能扩增7株乳酸杆菌，结果为阳性；阴性对照菌结果为阴性。结论：该方法快速、灵敏、特异。为啤酒中乳酸杆菌的快速检测提供了有效的途径。     

杭州市急性呼吸道感染儿童中WU多瘤病毒感染的流行病学及基因特征分析

目的 了解杭州市急性呼吸道感染儿童中WU多瘤病毒(WU polyomavirus,WUPyV)流行特征和基因型别。方法 收集2011年3月至2013年6月间至浙江省儿童医院就诊的急性呼吸道感染患儿的鼻咽吸取物,用聚合酶链反应(PCR)法扩增VP2编码基因和VP2/1中间序列,测序后进行分型。选取代表性病毒株进行基因组测序。结果 收集的722份标本中,10份为WUPyV阳性,检出率为1.4%。WUPyV感染主要发生在夏季、秋季和冬季。患儿平均年龄为13.6月龄,男女性别比为9:1,性别差异无统计学意义(P=0.09)。WUPyV感染所致疾病为肺炎、喉炎和细支气管炎。WUPyV基因型别为Ⅰa型。代表性毒株HZ13024的基因组大小为5229 bp,与GenBank中WUPyV基因组序列相似性为99.8%~99.9%。结论 杭州市儿童急性呼吸系统疾病中存在WUPyV感染,感染率较我国其他地区低,基因型别为Ⅰa型。     

杭州地区2009甲型H1N1流感重症患儿中人类偏肺病毒感染状况研究

目的了解杭州地区2009甲型H1N1流感（以下简称甲流）重症患儿中人类偏肺病毒（hMPV）的感染状况。方法采集2009年11月至2010年1月确诊为甲流重症患儿的呼吸道样本79份,用传统逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR方法检测hMPV及其他呼吸道病毒。选择hMPV阳性样本PCR扩增产物进行核苷酸测序,将所测序列与GenBank比对分析,并绘制基因进化树。结果79份甲流病毒阳性样本中,hMPV及其它呼吸道病毒阳性率20．25％（16,79）,hMPV阳性PCR扩增产物4份,占甲流重症病例的5．06％（4,79）。其中3份hMPV阳性PCR扩增产物核苷酸序列相似性为99．1％～99．5％,与广东省流行株GD．165,泰国株155N及B1代表株高度相似,并且被GenBank收录。结论杭州地区确诊感染的2009甲型H1N1流感重症病例中存在与hMPV共同感染状况,且hMPV均为B1基因型。     

杭州地区不同谱系乙型流感病毒流行特征

目的 了解杭州地区乙型流感病毒2个不同谱系的流行情况及对不同年龄段人群造成的影响。方法 收集杭州地区2013年10月—2019年9月流感样病例12 611例，real-time RT-PCR检测乙型流感病毒。对乙型流感病毒的流行模式和患者的年龄分布进行统计学分析。结果 2013年以来，杭州地区每年都有乙型流感病毒的流行，每个流感季以单一谱系的乙型流感病毒流行为主。Yamagata季和Victoria季的出现没有明显的规律性。仅2017年—2018年流感季出现了乙型流感病毒疫苗株与流行株不匹配的情况，但患者中位数年龄和发病率都没有显著的改变。单一谱系乙型流感病毒显著流行的流感季5岁～9岁年龄段人群发病率最高(P<0.001),2种谱系共同流行的流感季10岁～14岁年龄段人群发病率最高(P<0.001)。Victoria季乙型流感患者的中位数年龄最低(8岁，P<0.001),而Yamagata季65岁以上老人的发病率高于其他季节(P<0.001)。结论 乙型流感病毒不同流行模式下患者的年龄分布不同。应该根据不同的流行模式和主要影响的人群制定不同的乙型流感病毒防控措施...     

2016—2022年杭州流感病毒流行特征及儿童流感重症感染特征分析

目的了解儿童流感流行特征及流感重症的感染特征。方法收集2016年1月—2022年9月严重急性呼吸道感染住院病例样本1 600份, 门诊流感样病例监测样本7 660份。实时荧光PCR法检测流感病毒。并对流感住院重症病例样本及部分流感门诊病例样本进行其他呼吸道病毒的检测, 分析其临床感染特征和合并感染特征。结果 1 600份严重急性呼吸道感染住院病例样本中, 流感病毒阳性率为6.63%(106例), 甲型H1N1、H3N2、B Victoria(BV)、B Yanagata(BY)的占比分别为49.06%(52/106)、17.92%(19/106)、29.25%(31/106)和3.77%(4/106)。7 660份门诊病例中, 流感阳性率为15.01%(1 150例), 甲型H1N1、H3N2、BV、BY的占比分别为22.17%(255/1 150)、30.96%(356/1 150)、41.39%(476/1 150)和5.48%(63/1 150)。甲型H1N1流感病毒更容易引起儿童流感重症, 差异具有统计学意义(χ2=37.978, P<0.001), 而季节性H3N2和B...