抗人喉癌单克隆抗体的制备及其特性研究

采用Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人喉鳞状细胞癌单克隆抗体（ＭｃＡｂ），经筛选得到４株分泌ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株，全部收集到腹水型ＭｃＡｂ，并检测其特异性及生物学特性。结果该ＭｃＡｂ能与标准喉癌细胞株抗原特异性结合，抗体滴度≥１：１２８０倍，且能特异性地检测喉癌患者癌组织中的喉癌抗原；此ＭｃＡｂ纯度高，分子量在１００～２００ｋＤ之间。单克隆杂交瘤细胞染色体均为多倍体。     

特异性脱氧核酶对喉癌真核细胞起始因子4E基因mRNA的体外切割作用

目的 研究特异性脱氧核酶(10-23DNAzyme)对喉癌真核细胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF4E)基因mRNA的体外切割作用.方法 设计合成针对原癌基因eIF4EmRNA编码区的1102、1289、1226位点的3个10-23DNAzyme-eIF4E,用内切酶Xhol将含有eIF4E基因mRNA的pGEM7zf eIF4E质粒消化成线性.以此为模板体外转录出用[α-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA.在37℃,pH 7.5,Mg2 离子50 mmol/L条件下,分别与3个10-23DNAzyme-eIF4E(1 μmol/L)混合进行切割反应,并比较不同Mg2 离子浓度下酶对靶mRNA的切割活性.反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影,应用凝胶成像分析仪评价酶的切割效率.结果 在设定条件下,3个10-23DNAzyme-eIF4E对eIF4E基因mRNA均有切割活性,且随着Mg2 浓度越高,酶的切割活性增强.结论 3个10-23DNAzyme-eIF4E能有效切割eIF4E基因编码区mRNA,且切割效率与Mg2 浓度有关.     

喉癌中血管内皮生长因子C与淋巴转移的关系

目的：探讨喉癌中血管内皮生长因子C（Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）的表达与淋巴道转移的关系。方法：免疫组化SP法，对54例喉癌组织行VEGF-C检测及癌周组织毛细淋巴管计数，应用全自动图像分析仪对染色结果进行定量测定，以平均灰度值表示VEGF-C的染色强度。结果：喉癌组织内VEGF-C表达高于声带息肉（P〈0．05）；颈淋巴结转移组高于非转移组（P〈0．01）。癌周组织毛细淋巴管密度高于对照组正常喉组织（P〈0．01）；颈淋巴结转移组高于非转移组（P〈0．01）。喉癌组织内VEGF-C表达与癌周组织淋巴管密度呈正相关（r=0．603，P〈0．01）。结论：喉癌组织中VEGF-C的表达与癌周毛细淋巴管密度关系密切，VEGF-C高表达促进淋巴管增殖，促进淋巴道转移。     

PTEN基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞株中的表达

目的构建人PTEN基因的真核表达载体并在COS-7细胞中高效表达。方法从人喉粘膜组织中分离总RNA，经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到PTEN全基因。克隆入PTEM-Teasy载体上，经过PCR、酶切鉴定为阳性的克隆，进行测序分析。然后将所获得的基因定向克隆入PCI—neo载体中构建表达载体。并将其转入COS-7细胞中进行瞬时表达。结果反转录PCR扩增后的产物，在约1．4kb处可以看见特异性条带，序列分析表明与GenBank中的PIEN基因序列相同。PCI-PTEN真核载体转染COS-7细胞后的Westem blotting证明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应。结论成功构建出PIEN真核表达载体，诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白，为进一步研究PTEN在喉癌细胞株中的抑癌效果及抑癌机理奠定基础。     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

人喉癌细胞异质性亚群的克隆分离及性质初探

目的通过原代培养人喉癌细胞、克隆分离异质性细胞亚群,初步探讨喉癌异质性机制。方法原代培养人喉癌细胞,采用有限稀释法单细胞体外培养喉癌细胞,比较克隆分离得到的异质性亚群在功能状态、细胞周期、形态、在无血清干细胞培养基中生长情况及裸鼠异体移植成瘤能力等方面的差异。结果分离得到Ⅰ型和Ⅱ型两个具有明显形态差异的细胞亚群。Ⅰ型细胞呈多角形,突起多,裸鼠移植可成瘤(4/5);而Ⅱ型细胞呈长梭形,突起较少,裸鼠异体移植不成瘤(0/5)。Ⅰ型与Ⅱ型细胞相比,RNA含量低,体外增殖能力强,能在无血清干细胞培养基中聚集呈肿瘤细胞球状生长;Ⅰ型细胞处于细胞周期G0/G1的比例明显高于Ⅱ型细胞。对Ⅰ型细胞亚克隆培养,产生的子代克隆集落出现了异质性的细胞,而Ⅱ型细胞亚克隆培养未能产生子代细胞。结论原发性喉癌细胞中存在着异质性的肿瘤细胞亚群,Ⅰ型细胞具备肿瘤干细胞的特性。     

IgG4相关性疾病4例报告并文献回顾

目的 探讨IgG4相关性疾病的临床表现、病理学特征及影像学表现。 方法 分析4例IgG4相关性疾病的临床特征、组织病理学及影像学改变,并查阅相关文献进行总结。 结果 本组4例的平均年龄为55岁,男女比例为3∶1。分别发生于颌下腺2例、眼眶1例、颜面部1例。临床表现无显著特异性,均呈无痛渐进性肿胀。病理学改变为淋巴组织及纤维组织增生,其内有较多浆细胞浸润(IgG4阳性浆细胞>50个/HPF,IgG4阳性浆细胞>IgG阳性浆细胞的40%)。影像学上表现为病变区炎性改变。 结论 IgG4相关性疾病是目前临床较为少见的疾病,发病机制尚不明确。需结合临床表现、血清学检测、病理学特征及影像学表现做出最终诊断,进而行及时准确的治疗。     

pVVP3IL-18HN核酸疫苗的构建及其对喉癌细胞杀伤作用的研究

目的通过构建共表达凋亡素基因、新城疫病毒HN基因和白介素18（interleukin-18，IL-18）基因的核酸疫苗，观察联合应用此三种基因对喉癌细胞的杀伤效应。方法在真核表达质粒pVAX1中的CMV启动子下游插入凋亡素基因和含有IL-18HN嵌合基因并携带IRES启动子的基因片段，构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pVVP3IL-18HN，经RT—PCR、间接免疫荧光和Western—blot法检测外源基因的表达。采用脂质体介导法将构建的重组质粒pVVP3IL-18HN体外转染Hep-2细胞，运用MTT法检测不同质粒浓度、不同作用时间，该重组质粒对喉癌细胞Hep-2的杀伤率。结果pVVP3IL-18HN可有效杀伤喉癌细胞，且在作用72h、质粒浓度为20μg／ml时杀伤率最高，达61．9％。结论重组质粒pVVP3IL-18HN能有效杀伤Hep-2细胞，可用于喉癌的治疗和研究。     

Bmi-1在喉癌组织中的表达及相关性

目的探讨Bmi-1在喉癌组织和癌旁组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法收集10例喉癌患者的癌组织及癌旁组织，采用RT-PCR方法检测其Bmi-1mRNA表达情况；采用sP免疫组织化学法对46例喉癌患者手术标本石蜡切片进行染色，检测Bmi-1蛋白的表达，并分析Bmi-1与临床病理特征的相关性。结果喉癌组织中Bmi-1mRNA表达水平明显高于癌旁对照组织。Bmi-1蛋白在喉癌中的阳性表达率为67．39％。Bmi-1的表达与喉癌的临床分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度密切相关（P〈0．05），而与患者的性别、年龄、临床分型等无关。结论Bmi-1在喉癌组织中表达状态与喉癌的生长和转移关系密切，可以作为反映喉癌生物学行为的有效指标。     

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的 研究凋亡抑制蛋白Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的表达,探讨其在喉癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组织化学技术,研究42例喉癌标本、20例癌旁组织、20例喉角化症、10例正常喉黏膜中Survivin 蛋白的表达情况;并用RT-PCR技术检测喉癌细胞株Hep-2中Survivin mRNA的表达。结果 正常喉黏膜中无Survivin表达, 喉癌组织中Survivin 蛋白的表达 (66.6 %) 明显高于癌旁组织 (40.0 %)和喉角化症(35.0 %)(P<0.001),喉癌组织中Survivin表达与临床分期、病理分级及有无颈淋巴结转移无明显相关性(P > 0.05)。喉癌细胞株Hep - 2中有较强Survivin mRNA的表达。结论 Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的高表达可能与喉癌的发生关系密切,具体机制有待于进一步研究。