蛇床子素诱导内质网应激抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的机制研究＊

目的 研究蛇床子素抑制肝癌细胞增殖的机制。方法 采用20 - 100 μM蛇床子素干预SMMC7721人肝癌细胞24 h、48 h和72 h，运用MTT方法检测细胞增殖；采用20 - 80 μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞24 h，运用流式细胞术检测细胞凋亡及Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达；采用 60 μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞48 h，运用流式细胞术检测细胞周期，以实时荧光定量PCR技术检测GRP78、DDIT3、GADD34、ATF4、EIF2A、GDF15、CDKN1B、FOXO3、RICTOR、SGK1基因表达，Western blot方法检测CyclinD1、CyclinE1、p27^Kip1和CDK4细胞周期蛋白及GRP78、GRP94、PERK、XBP-1s、CHOP、p-eIF2α(Ser51)内质网应激蛋白表达。各实验均以0.1% DMSO为对照组，并以0.1 μM毒胡萝卜素为内质网应激诱导剂组。结果 与对照组比较，100 μM蛇床子素干预24 h显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖，其抑制率为36.76%（P < 0.05）；60 - 100 μM蛇床子素干预48 h后显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖，抑制率为30.84%-52.49%（P < 0.05）；40 - 100 μM蛇床子素干预72 h后显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖，抑制率为32.7%-73.15%（P < 0.05）。大于60 μM蛇床子素可诱导SMMC7721肝癌细胞晚期凋亡且显著抑制促凋亡蛋白Bax表达（P < 0.05）。60 μM蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞48 h后，G1期细胞数增加、G2期和S期减少，且CyclinD1、CyclinE1和p27^Kip1蛋白表达显著被抑制（P < 0.05）。20 - 80 μM蛇床子素处理SMMC7721肝癌细胞24 h后，均显著促进GRP78、DDIT3（CHOP）、ATF4、FOXO3、RICTOR和SGK1基因表达（P < 0.05）； 20 μM蛇床子素显著促进GADD34和EIF2A基因表达（P < 0.05）；80 μM蛇床子素显著促进GDF15基因表达（P < 0.05），且CHOP、XBP-1s蛋白表达显著增强。结论 蛇床子素通过诱导内质网应激反应以抑制SMMC7721肝癌细胞增殖，从而发挥抗肝癌活性。     

经典气血阴阳虚证模型小鼠在“肾藏象”层面的证候物质基础研究

目的研究气血阴阳虚证模型小鼠在"肾藏象"层面的证候物质基础。方法以雄性ICR小鼠为对象,以控食法复制气虚证模型,以乙酰苯肼复制血虚证模型,以甲状腺素复制阴虚证模型,以氢化可的松复制阳虚证模型。动态观察小鼠体质量变化,检测各脏器变化;取肾脏、肾上腺和骨髓组织抽提RNA,以实时荧光定量PCR技术检测相关基因表达;以ELISA方法检测血清皮质酮含量。结果 (1)与正常对照组比较,控食组小鼠体质量下降最显著(P0.01),乙酰苯肼和氢化可的松组小鼠体质量也显著下降(P0.05);控食组和氢化可的松组小鼠脾脏与胸腺明显萎缩(P0.01),乙酰苯肼组小鼠脾脏显著肿大、而胸腺严重萎缩(P0.01)。(2)与正常对照组比较,控食组和乙酰苯肼组血清皮质酮水平显著升高(P0.05),而氢化可的松组显著下降(P0.001)。(3)控食组小鼠肾上腺合成皮质激素的重要酶Star、Cyp21a1、Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo表达显著升高(P0.05),Csf2显著下降(P0.05);骨髓Tpo、IL-4表达显著上调(P0.05)。(4)乙酰苯肼组小鼠肾上腺Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo、Csf2、Csf3表达显著升高(P0.05);骨髓Csf3、IL-4、IL-5、IL-6表达显著升高,而IL-1b和IL-7显著下降(P0.05)。(5)甲状腺素组小鼠肾上腺Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo表达显著升高,Csf2显著下降(P0.05);骨髓Csf3、IL-2和IL-5表达显著下降(P0.05)。(6)氢化可的松组小鼠Star、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2表达显著下降(P0.05),肾脏Epo表达显著升高,而Csf1和Csf2显著下降(P0.05),骨髓Csf3、IL-1b、IL-5和IL-7表达显著下降,IL-4却显著升高(P0.05)。结论通过控制摄食量,给予乙酰苯肼、甲状腺素及氢化可的松,可以复制出相关的中医虚证模型,且在肾上腺、肾脏及骨髓等"肾藏象"层面存在相应的物质功能变化。     

不同剂量氢化可的松诱发小鼠药源性脾肾虚证的评价研究

目的评价氢化可的松诱发小鼠药源性脾肾虚证模型,并探索其物质基础。方法 80只ICR小鼠按随机分为对照组、极低、低、中、高剂量组,每组16只,分别采用灭菌水、0.33、0.66、3.3、12.5 mg/(kg·d)氢化可的松灌胃。每日动态观测小鼠体重,并分别在给药第7天和第14天,检测小鼠抓力、旷场活动度、躯体不同部位红外温度等表征信息。分别于给药第8天和第15天各处死小鼠8只,取脾脏、胸腺、心脏和肾脏称重并计算脏器指数;ELISA检测血清皮质酮(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)含量;实时荧光定量PCR检测肾上腺StAR、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2 mRNA表达;Western Blot检测肾上腺LDLR、SRBI、StAR蛋白表达。结果与对照组同期比较,低、中剂量组4～14天体重下降(P0.05),极低剂量组7天尾部最低温度、StAR、Cyp21a1 mRNA表达,14天头部最高温度、躯干平均温度、尾部最低温度以及ACTH含量、LDLR、StAR蛋白表达下降(P0.05,P0.01),14天抓力上升(P0.05);低、中、高剂量组7、14天头部最高温度、躯干平均温度、尾部最低温度、胸腺重量和指数下降(P0.05,P0.01);低剂量组7、14天StAR mRNA、LDLR、StAR表达下降(P0.05,P0.01),14天CORT含量、ACTH、Cyp11a1、Cyp11b1 mRNA表达下降(P0.05,P0.01);中、高剂量组7、14天脾脏重量和指数、CORT含量、ACTH、StAR、Cyp21a1、Cyp11b1 mRNA、LDLR、SRBI、StAR表达下降(P0.05,P0.01),14天Cyp11a1、Cyp11b2 mRNA下降(P0.05,P0.01);高剂量组14天体重、旷场活动度下降(P0.05)。结论采用0.66及3.3 mg/(kg·d)氢化可的松持续给药14天可建立稳定的药源性脾肾虚证小鼠模型,可能与其降低肾上腺皮质激素合成酶表达和垂体-肾上腺皮质轴功能有关。     

不同中药药对调节氢化可的松药源性证候小鼠肾上腺皮质功能的研究

目的研究不同治法中药配伍调节肾上腺皮质功能的作用。方法小鼠ig给予1.65 mg/(kg·d)氢化可的松14 d诱发药源性证候,同步给予助阳散寒(附子-肉桂)、滋阴泻火(知母-黄柏)、补气生津(人参-黄芪)、补血益精(熟地-山茱萸)4种中药药对干预,检测小鼠体质量、抓力、腋温、旷场活动度、躯体不同部位红外温度等表征信息;取脾脏、胸腺称定质量并计算脏器指数;运用ELISA法检测血清皮质酮、促肾上腺皮质激素(ACTH)、肾上腺素和去甲肾上腺素含量;采用实时荧光定量PCR技术检测肾上腺类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21-羟化酶(Cyp21a1)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)和11β-羟化酶2(Cyp11b2)、酪氨酸羟化酶(Th)、多巴胺脱羧酶(Ddc)、多巴胺β-羟化酶(Dbh)、苯乙胺-N-甲基转移酶(Pnmt)基因表达;运用Western blotting方法检测肾上腺低密度脂蛋白受体(LDLR)、B族I型清道夫受体(SR-BI)、StAR蛋白表达。结果 4种治法对氢化可的松造成的小鼠体质量下降和体温下降效果不显著,附子-肉桂组小鼠抓力显著高于模型组(P0.05)。与模型组比较,知母-黄柏组小鼠血清皮质酮含量显著升高(P0.01),StAR、Cyp11b1、Cyp11b2基因表达水平显著升高(P0.05、0.01),SR-BI、StAR蛋白表达水平均显著升高(P0.01)。结论滋阴泻火治法寒性药对(知母-黄柏)对小剂量氢化可的松诱发的药源性证候小鼠肾上腺皮质功能的纠正作用最佳。     

氢化可的松减停给药致小鼠药源性阴虚证及其对肾上腺皮质功能的影响

目的:研究小剂量氢化可的松长期给药及减停后对小鼠证候和肾上腺皮质功能的影响。方法:96只雄性ICR小鼠随机分为对照组和氢化可的松低、中、高剂量(0.33、0.66、1.32mg·kg~(-1)·d~(-1))组,每组24只。氢化可的松组小鼠实验第1～28天灌胃给予相应剂量的氢化可的松溶液,实验第29～35天灌胃给予原剂量减半的氢化可的松溶液,实验第36～49天停药。对照组小鼠实验第1～35天灌胃给予等体积灭菌水。实验期间,每周定期测定每只小鼠的体质量。分别于实验第27、41、48天,采用小鼠辨证论治实验方法学检测小鼠腋温、四肢抓力和旷场活动度。分别于实验第28、42、49天,取每组8只小鼠,分离胸腺、脾脏、肾上腺组织,采集血清。计算胸腺与脾脏的脏器指数;ELISA检测血清皮质酮含量;PCR检测肾上腺类固醇激素合成急性调节蛋白(Star/StAR)、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1的mRNA表达;Western blot检测StAR、B族Ⅰ型清道夫受体(SRBⅠ)、低密度脂蛋白受体(LDLR)的蛋白表达。结果:(1)药物干预期间,氢化可的松各剂量组小鼠体质量增长缓慢,显著低于同期对照组(P0.05,P0.01);停药后各剂量组小鼠体质量快速增长,与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。实验第28天,氢化可的松高剂量组小鼠的腋温较对照组显著下降(P0.01),停药后恢复正常水平。在各观察时间点,各组小鼠四肢抓力和旷场活动度比较,差异均无统计学意义(P0.05)。(2)与对照组同期相比,实验第28天,氢化可的松各剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均显著下降(P0.05,P0.01);实验第42天,中、高剂量组小鼠的脾脏指数显著降低(P0.05);实验第49天,高剂量组小鼠的脾脏指数仍显著降低(P0.05)。(3)在各观察时间点,氢化可的松各剂量组小鼠的血清皮质酮含量较对照组均显著降低(P0.01)。(4)与对照组同期相比,实验第28天,氢化可的松中剂量组小鼠肾上腺组织Cyp21a1 mRNA表达显著下降(P0.05),高剂量组Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1的mRNA表达显著下降(P0.05,P0.01);实验第42天,中剂量组Star mRNA表达恢复性上调(P0.05);实验第49天,低剂量组Cyp21a1、Cyp11b1的mRNA表达恢复性上调(P0.01),中剂量组Star、Cyp11a1的mRNA表达恢复性上调(P0.01),高剂量组Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1的mRNA表达恢复性上调(P0.01)。(5)与对照组同期相比,实验第28天,氢化可的松低剂量组小鼠肾上腺StAR蛋白表达量显著降低(P0.01),中剂量组StAR、SRBⅠ蛋白表达量显著降低(P0.01),高剂量组LDLR、StAR、SRBⅠ蛋白表达量均显著降低(P0.01);实验第42天,低剂量组LDLR蛋白表达量显著升高(P0.05);实验第49天,低剂量组LDLR、SRBⅠ、StAR蛋白表达水平与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05),中剂量组StAR以及高剂量组LDLR和StAR蛋白表达水平仍显著下降(P0.05,P0.01)。结论:小剂量氢化可的松长期给药可诱发小鼠阴虚证表象,抑制其肾上腺皮质功能;药物减停后,小鼠外观表征恢复较快,而肾上腺皮质酮分泌功能恢复较慢。     

乙酰苯肼致血虚证模型小鼠的证候物质基础初探

目的 研究乙酰苯肼引起的血虚证模型小鼠证候可能的物质基础。方法 以雄性ICR小鼠为对象，采用乙酰苯肼170 mg/kg皮下注射，第1天和第4天各1次制作血虚证模型，并设立正常对照组。动态观察小鼠体重变化，显微镜下观察血液细胞与股骨骨髓细胞，取肾脏、肾上腺和骨髓分别抽提RNA，以实时荧光定量PCR技术检测相关基因表达、以ELISA方法检测血清皮质酮含量。结果 与正常对照组比较，乙酰苯肼小鼠造模3天后体重显著下降（P<0.05），小鼠呈现虚弱征象，小鼠脾脏代偿性增大而胸腺却明显萎缩（P<0.01）。乙酰苯肼组小鼠血液红细胞形态异常、正常红细胞数量减少、白细胞代偿性增多；骨髓成熟的环状核细胞减少。与正常对照组比较，乙酰苯肼组小鼠骨髓IL-5和IL-6基因表达显著升高（P<0.05），而巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-1b和IL-7基因表达显著下降（P<0.05）；肾脏促红细胞生成素（Epo）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和M-CSF基因表达也显著升高（P<0.05， P<0.01），而粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因表达则被乙酰苯肼抑制（P<0.05）；肾上腺Cyp21a1与Cyp11b1基因表达显著升高（P<0.05）；小鼠血清皮质酮含量明显升高（P<0.01）。结论 乙酰苯肼所复制的证候以血虚证为主，脾脏肿大、肾脏Epo基因代偿性高表达以及继发肾上腺皮质功能虚性亢奋是该证候物质与功能变化最突出特征。     

中医血虚证及其动物模型制备方法评析

创建稳定、可信、经典、实用的中医证候动物模型是深入证候物质基础研究的基础与前提。通过以血虚证为切入点,首先明确了中医血虚证的概念,并且比较了血虚证与现代贫血性血液疾病的差异;其次基于中医证候的病因病机,分类整理了目前可以搜集到的血虚证造模方法,以及整理概括了相关检验指标和不同造模方法的特点;并对目前中医血虚证动物模型存在的问题与建立新的血虚证动物模型进行了思考。认为血虚证模型的建立亟待能模拟临床诊治思维,且在理论上具有可行性、于实践上具有可操作性的制备方法。     

六味地黄汤和桂附地黄汤对小剂量氢化可的松减停给药后致小鼠药源性虚证的调节作用

目的:研究补肾复方对小剂量氢化可的松减停给药诱发的小鼠证候及肾上腺皮质功能的影响。方法:48只雄性ICR小鼠随机分为正常组、氢化可的松组、六味地黄汤组、桂附地黄汤组,每组12只。每组给予1.32 mg·kg^-1·d^-1氢化可的松28 d减半剂量7 d停止用药14 d造模,减量及停药阶段同步给予相应组六味地黄汤药液12.5 g·kg^-1·d^-1,桂附地黄汤药液13.5 g·kg^-1·d^-1,连续21 d。实验第28,49天采用小鼠辨证论治实验方法学检测小鼠表征信息(抓力、体表红外温度);在实验第50天处死小鼠取材,摘取脾脏、胸腺,计算脾脏与胸腺脏器指数;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清皮质酮含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肾上腺类固醇合成急性调节蛋白(Star),胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1),细胞色素P450家族21亚家族A多肽1(Cyp21a1),细胞色素P450家族11亚家族b多肽1(Cyp11b1),低密度脂蛋白受体(Ldlr),B类I型清道夫受体(Scarb1/SRBI),3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hmgcr),酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶-1(Acat1),激素敏感性脂肪酶(HSL/LIPE),胰岛素诱导基因1(Insig1),固醇调节元件结合转录因子2(Srebf2)mRAN表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测低密度脂蛋白受体(LDLR),B类I型清道夫受体(Scarb1/SRBI),胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1),胆固醇21-羟化酶(CYP21A2)蛋白表达。结果:与正常组比较,连续给药28 d后,模型组小鼠体质量与躯体平均红外温度均显著下降(P<0.01);减停造模后,模型组小鼠抓力明显下降(P<0.05),胸腺指数显著升高(P<0.01),血清皮质酮含量明显降低(P<0.05),肾上腺Cyp21a1,Hmgcr mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.01),Lipe,Acat1 mRNA表达显著上升(P<0.01),肾上腺CYP11A1,SRBI蛋白表达显著下降,LDLR蛋白表达上升。与模型组比较,中药治疗21 d后,桂附地黄汤组小鼠体质量显著下降(P<0.01);六味地黄汤组小鼠脾脏指数显著下降(P<0.01);桂附地黄汤组Cyp11a1,Cyp21a1,Acat1,Lipe mRNA表达明显上升(P<0.05,P<0.01),Ldlr,Scarb1 mRNA表达明显下降(P<0.05),六味地黄汤组Ldlr,Acat1,Lipe mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.01);六味地黄汤及桂附地黄汤组CYP11A1,SRBI蛋白表达上升。结论:桂附地黄汤可通过纠正肾上腺皮质激素合成酶的表达,以促进药源性虚证小鼠肾上腺皮质功能恢复。     

补肾健脾法对氢化可的松诱发的脾肾虚证小鼠肾上腺功能的影响

目的研究补肾健脾法对氢化可的松诱发的脾肾虚证小鼠肾上腺功能的影响。方法将60只ICR小鼠随机分为正常对照组、氢化可的松组、四君子汤组[12.75 g(生药)/kg]、六味地黄汤组[12.5 g(生药)/kg]、桂附地黄汤组[13.5 g(生药)/kg],连续灌胃给药氢化可的松(1.65 mg/kg)14 d建立药源性证候模型;各中药复方组在灌胃氢化可的松的同时及停止氢化可的松灌胃后7 d,每日分别灌胃给药3个中药复方。每日称定小鼠体质量;在第14、21天,运用小鼠辨证论治实验方法学观测小鼠四诊指标;在第15、22天,计算脾脏、胸腺指数,ELISA检测血清皮质酮、促肾上腺皮质激素、肾上腺素和去甲肾上腺素水平,采用实时荧光定量PCR技术检测Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2、Dbh、Ddc、Pnmt、Th mRNA表达,Western blot检测LDLR、SRBI、Star蛋白表达。结果氢化可的松干预后,小鼠体质量,抓力,尾部最低温度,脾脏、胸腺指数,血清皮质酮、促肾上腺皮质激素水平显著下降(P<0.05,P<0.01);显著抑制相关肾上腺类固醇激素合成酶(Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1)mRNA表达(P<0.05,P<0.01),并抑制胆固醇转化为肾上腺类固醇激素过程中相关蛋白(LDLR、SRBI、StAR)表达。与氢化可的松组比较,桂附地黄汤组显著增加小鼠抓力(P<0.01),四君子汤组、六味地黄汤组和桂附地黄汤组显著升高血清皮质酮均水平(P<0.01),四君子汤组、桂附地黄汤组明显抑制Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1 mRNA表达(P<0.05,P<0.01),3个复方组能改善LDLR、SRBI、StAR蛋白下降。结论桂附地黄汤对小鼠阳虚证候有所改善,3个中药复方对小鼠阴虚证候疗效不显著。3个中药复方对氢化可的松诱发的肾上腺皮质功能抑制均有缓解作用。     

真武汤通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制H22肝癌小鼠肿瘤增长的研究

目的研究真武汤对肿瘤增长的影响及可能的作用机制。方法将雄性昆明种小鼠随机分为正常对照组8只,肿瘤模型组15只,肿瘤真武汤组15只。除正常对照组外,接种H22肝癌细胞至腋下复制荷瘤模型小鼠并同步给予真武汤防治14天。动态观测小鼠体质量与肿瘤大小变化;处死小鼠后,取脾脏、胸腺称重并计算脏器指数;采用实时荧光定量PCR技术检测肾上腺Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1以及肿瘤Akt1、Cdkn1b、Mtor、Pik3r1、Pten的mRNA表达;运用Western blot方法检测肾上腺SRB1、St AR和肿瘤AKT、P-AKT蛋白表达。结果与正常对照组比较,肿瘤模型组脾脏显著增大(P0.05);肾上腺Cyp11a1、Cyp11b1的基因表达显著下调(P0.05)。与肿瘤模型组比较,真武汤防治后小鼠生存率80%显著高于模型组53.3%(P0.05),且抑制肿瘤快速增长;同时真武汤显著促进肿瘤组织Pik3r1、Cdkn1b基因表达上调(P0.05)、抑制p-AKT蛋白表达(P0.05),并显著增强肾上腺St AR蛋白表达(P0.05)。结论真武汤通过调节PI3K-AKT-mTOR信号通路关键分子抑制肿瘤快速增长,并通过改善肾上腺与脾脏功能延长生存期。