变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定

目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因（gbpD）失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.     

人类遗传病的动物模型

应用基因打靶的方法，可以制造出人类遗传性疾病的动物模型，这种动物模型有利于单基因遗传病的研究。本文简述了遗传病动物模型的制作方法及其中的问题，指出了遗传背景对于动物模型的重要性。在不同的遗传背景下培育突变动物会发现一些有调节作用的基因，有利于改善动物模型。因为人与动物某些基因表达的不同，有些遗传病的症状不能在动物模型中复制。人类多基因遗传病的影响因素复杂，动物模型较难制作，但会对这类疾病的研究，尤     

基因打靶技术及其在眼科领域的应用

基因打靶是近十年来发展起来的分子生物学技术,此项技术的应用和发展为人们在整体水平研究基因的功能及其调控、建章人类疾病动物模型和发展基因疗法提供了可靠的手段。本文综述了基因打靶技术的概况以及其在眼科疾病研究中的应用。     

大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型

目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。     

利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体

目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体（retrieving vector）,应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复（gap-repair）方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2（Ins2）基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点（IRES）序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体（mini-targeting vector）,最后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体。结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体。结论 成功构建了在胰岛β细胞中特 异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料。     

α1,3GT siRNA打靶杂合子猪肝细胞阴性表达半乳糖转移酶

目的 研究联合应用基因敲除及RNA干扰(siRNA)技术对猪α1，3半乳糖转移酶(α1，3GT)基因修饰后，阳性猪杂合子( ／-)肝细胞的GT基因是否获得有效沉默并影响人天然抗体介导的细胞毒性作用。方法用pPNTloxPneo和PMXSV／U6载体构建猪GT基因敲除并siRNA载体，转染中国实验用小型猪的肝细胞，筛选获取杂合子克隆( ／-)。Northern blot检测GT mRNA表达，四甲基偶氮唑盐方法评估天然抗体细胞毒性。结果 野生型和pPNTloxPGT转染的杂合子猪肝细胞的inRNA表达阳性，而pPNTloxPGTsiRNA载体转染的杂合猪肝细胞阴性表达α1，3GT mRNA;pPNTloxPGT转染细胞( ／-)和野生型( ／ )猪肝细胞对人天然抗体介导的细胞毒性实验敏感，而pPNTloxPGTsiRNA转染细胞( ／-)则对毒性试验敏感性明显下降，只检测到17％细胞毒性。结论 对猪GT联合应用基因敲除及SiRNA能够在阳性猪杂合子肝细胞内有效沉默GT基因，降低猪肝细胞对人天然抗体细胞毒的敏感性。     

牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株的构建

目的构建牙龈卟啉单胞菌毒力岛基因PG0839突变菌株,为研究PG0839基因功能提供实验基础。方法扩增1 584 bp PG0839基因片段,对聚合酶链反应（PCR）产物和pUC19载体进行BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,连接酶切产物得到质粒pPG0839-1。将2 101 bp erm基因产物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRⅤ位点,构建质粒pPG0839-2,作为电穿孔的供体质粒。电穿孔转化于受体菌牙龈卟啉单胞菌W83菌株,红霉素抗性培养基筛选阳性克隆,命名为PG0839基因突变菌株。结果运用插入失活方法构建PG0839基因突变菌株,进而通过酶切、测序、PR和反转录PCR对PG0839基因突变菌株进行验证,证实PG0839基因突变菌株构建成功。结论本实验成功构建PG0839基因突变菌株。     

细胞重编程及其在再生医学中的应用前景 ——写在2012年诺贝尔生理学或医学奖颁布之际

2012年10月8日,英国发育生物学家约翰·格登爵士(John B.Gurdon)和日本生物医学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)因"发现成熟细胞可以被重编程(reprogrammed)为多能性(pluripotency)"而获奖,这次获奖是在短短五年时间内干细胞领域的第二次获奖,上一次获奖是在2007年,马丁·埃文斯因1981年成功分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)而与另外两名从事"基因打靶"(gene targeting)的科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯共享诺贝尔生理学或医学奖.