rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

利用PCR技术优化人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因

本研究利用ＰＣＲ技术将人单核细胞趋化蛋白－１基因（ＭＣＰ－１）５′端翻译起始区进行优化改构。结果表明，改构后的ＭＣＰ－１基因克隆入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中，ＤＮＡ测序证实正确。上述结果为进一步研究ＭＣＰ－１的高效表达奠定了基础。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCGl)．以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌，观察不同剂量的质粒(pCGl)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明．注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别，而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后弟15～20天左右表达量最高。平均约91ng／ml。生物学恬性检测结果显示，注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量．     

人铜锌超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及在酿酒酵母中的分泌表达

目的:探讨酿酒酵母中人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的分泌表达.方法:采用RT-PCR技术从人胃总RNA中分离扩增hCu/Zn-SOD的cDNA,与酿酒酵母交配因子(MF)α信号肽编码序列融合,将融合基因插人大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2.0,构建真核分泌表达质粒pYES-MS,将其转化入酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl中,用半乳糖进行诱导表达,采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析及电泳谱活性染色测定表达产物分泌情况及其活性.结果:该工程菌可高效表达一相对分子质量约为21 000的蛋白并与兔抗人Cu/Zn-SOD多抗有特异的免疫反应,同时在培养基上清中检测到此表达蛋白的分泌,具有特异性SOD酶活性.结论:作者成功构建了pYES-MS/INV菌株,该菌株大量表达有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,并有部分hCu/Zn-SOD分泌到酵母细胞外,为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础.     

人肺癌细胞cDNA表达文库的构建

用磁珠从肺癌细胞株A549中直接分离mRNA.以随机六聚体为引物,在M-MLV反转录酶作用下,合成cDNA第一链,在RNaseH和DNA聚合酶的共同作用下合成双链cDNA,经T_4DNA聚合酶使其末端平齐化后,连接到经EcoRI酶切后消平的质粒表达载体中,电击转化E.coliDH5α.该文库大小约为9.0×10~5,重组子阳性率达85%,插入的cDNA长度约在0.5～4kb之间.以该文库cDNA为模板,应用PCR方法,首次从肺癌细胞中获得了死亡蛋白酶CPP32基因.该cDNA文库的构建为筛选调节肺癌细胞死亡的其它基因打下了基础.     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。     

p21的研究进展

ｐ２１作为一个由１６４个氨基酸组成的蛋白质，是细胞周期中重要的调控因子，协调ＤＮＡ的复制和修复，在细胞的生长，分化和衰化过程中起重要的作用，本文就ｐ２１近几年来的研究的进展作了一综述。     

表达自杀基因的减毒伤寒沙门氏菌对肿瘤的抑制作用

目的 研究表达自杀基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌对肿瘤的抑制作用。方法 把表达自杀基因的质粒（pc-CD)导入减毒的鼠伤寒沙门氏菌,以荷瘤鼠为模型研究沙门氏菌／自杀基因与5－FC系统对肿瘤的抑制作用。结果 该系统能抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠的存活期。结论 鼠伤寒沙门氏菌可以作为基因治疗的候选载体。