嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19~+套式淋巴瘤细胞的杀伤

目的探讨靶向CD19分子的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19-CAR-T)与未被基因修饰的T细胞相比,是否可以提高对CD19+的套式淋巴瘤细胞的杀伤率。方法通过基因合成和分子克隆手段构建CD19-CAR片段,将CD19-CAR片段克隆到慢病毒载体上,然后用慢病毒对T细胞进行转染。利用PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术检测目的蛋白在T细胞上的表达。最后用流式细胞术检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。结果未被基因修饰的T细胞对CD19阳性的Jeko-1、Rec-1、Maver-1细胞的杀伤效率分别为30%、17%和32%,而CAR-T细胞对上述3种肿瘤细胞的杀伤效率分别为78%、60%和75%。未被基因修饰的T细胞对CD19阴性的293T细胞的杀伤效率为13%,CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效率为24%。结论经CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞可特异性识别CD19分子,对CD19阳性的套式淋巴肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的T细胞,显示出CD19-CAR-T在套式淋巴细胞肿瘤免疫治疗的巨大潜力。     

CD7纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7阳性急性髓系白血病细胞的杀 伤活性

目的：针对CD7阳性的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞开发一种新型的CD7嵌合抗原受体修饰 的T细胞（CD7-CAR-T）,观察其对CD7阳性AML细胞的杀伤作用。方法：基于CD7纳米抗体序列、CD28和4-1BB共刺激域序 列构建CD7-CAR慢病毒载体,包装病毒颗粒并与CD7蛋白阻断剂（protein expression blocker,PEBL）慢病毒共感染人T细胞, 制 备CD7-CAR-T;应用实时无标记动态细胞分析技术（real time cellular analysis,RTCA）验证CD7-CAR-T对CD7过表达的293T细 胞的特异性杀伤能力,流式细胞术检测CD7-CAR-T对CD7高、中、低表达的AML细胞（KG-1、HEL、Kasumi-1细胞）的增殖和细 胞因子分泌的影响。结果：成功构建CD7-CAR-T 细胞并阻断其表面 CD7 的表达,与 T 细胞相比,CD7-CAR-T 细胞可以抑 制 CD7-293T 细胞的增殖并促进其分泌 TNF、Granzyme B 和 INF-γ,可显著促进 CD7 阳性的 KG-1 细胞和 HEL细胞的凋亡 （t=147.1、 P＜0.01; t=23.57、 P＜0.01）和细胞 因 子 分 泌（P＜0.05 或 P＜0.01）,而对低表达 CD7 的 Kasumi-1 细胞无显著影响 （t=0.7058、 P＞0.05）。结论： CD7-CAR-T细胞能够特异性杀伤CD7阳性的AML细胞。     

靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤

目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(pCD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列.分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞.最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19+细胞的杀伤率.结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3％,Raji为85.6％,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72％的NK-92MI细胞对CD19+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)％vs(24.7±6.2)％和(51.8±7.9)％vs(27.6±9.6)％,均P＜0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)％vs(17.7±2.9)％,P＞0.05].结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞.     

建立改良型人NK细胞体外扩增技术

目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性实验检测杀伤效率。结果经过21 d的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度最高可达95.86%。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。结论 p APC-mb IL-21工程细胞联合IL-2能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的NK细胞,可以为NK细胞免疫治疗奠定基础。     

靶向EGFR 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL 的制备及其体外活性测定

目的:构建基于EGFR 纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR 肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR 的纳米抗体7D12 以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4 与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL 连接,构建原核表达载体pET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot 验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR 阳性细胞A549、HT29、MCF-7 和EGFR 阴性细胞CEM、Jurkat 的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1 试剂检测BI7D12-PE38KDEL 对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE 和Western blot 实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL 能够与EGFR 阳性的A549、HT29、MCF-7 肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM 和Jurkat 相比具有极其显著性差异(P<0.01)。结论:成功地构建了基于EGFR 纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR 阳性的肿瘤细胞。     

嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对 HER2 阳性乳腺癌细胞的杀伤

目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率.方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染;应用流式细胞术检测细胞转染效率以及转染前后NK-92MI的IFN-γ和颗粒酶分泌差异;使用7-AAD和流式细胞术体外检测HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤效率;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型进行体内细胞毒性的检测.结果:用HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7和T47D的杀伤效率明显高于未被基因修饰的NK-92MI细胞[分别为(62.4±1.3)％ vs (22.1±1.2)％和(50.0±1.9)％vs(16.9±0.6)％,P＜0.01];而两者对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤效率没有明显差异[(13.6±1.4)％vs(12.7±0.8)％,P＞0.05].同时,经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞相比未被基因修饰的NK-92MI细胞,IFN-γ的分泌明显升高(P＜0.01).结论:经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率明显提高,且具有特异性靶向,此为治疗乳腺癌等恶性肿瘤提供了临床依据.