PD-S15 融合蛋白体外特异性靶向PD-1 分子并快速扩增NK/T细胞

[摘要] 目的：探讨anti-PD-1（scFv）/IL-15/IL-15Rα-sushi （简称PD-S15）融合蛋白体外特异性结合PD-1 的能力及其对NK/T细胞增殖能力的影响。方法：化学合成人anti-PD-1（scFv）基因和人IL-15/IL-15Rα-sushi 融合基因,经过酶切连接构建重组表达质粒pUC57-PD-S15,用LipofectamineTM 2000 瞬时转染HEK293T细胞,收获细胞培养液上清,用Wb法检测细胞培养液上清中PDS15融合蛋白的表达;用不同配比的PD-S15/X-VIVOTM15 培养液对PBMC和TIL 分别诱导培养后,用流式细胞术检测PD-S15 融合蛋白体外特异性结合PD-1 的能力和对PBMC增殖及CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3-CD56+各细胞亚群比例的影响;用细胞计数法检测PD-S15 融合蛋白对TIL 增殖能力的影响。结果：pUC57-PD-S15 表达质粒经双酶切和测序验证构建成功并成功转染HEK293T细胞,目标蛋白相对分子质量大约为55 000,符合预期。PD-S15 融合蛋白体外具有PD-1 特异性结合能力（P<0.05）及NK/T细胞活化增殖能力（P<0.05）;与经典TIL 培养方案相比,PD-S15 培养方案体外活化扩增T细胞的能力更强（P＜0.01）。结论：PD-S15 融合蛋白体外能够特异性靶向PD-1 分子并快速扩增NK/T细胞,为后续从肿瘤组织内或外周血中选择性扩增CD8+PD-1+抗原特异性T细胞奠定了基础。     

蛋白激酶B抑制剂对肝癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞生物学活性的影响

目的探讨蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抑制剂对肝癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)生物学活性的影响。方法肝癌患者4例,取其手术切除肿瘤组织标本密度梯度离心法分离TIL,并分为白细胞介素(interleukin,IL)-2组(6 000u/mL IL-2)和Akt抑制剂组(1mmol/L Akt抑制剂+6 000u/mL IL-2),培养第10天,2组均加入抗CD3抗体,继续原培养液培养20d。依据细胞增殖倍数绘制生长曲线检测TIL增殖活性;流式细胞法检测2组T淋巴细胞亚型及TIL分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的能力;ELISA法检测TIL培养上清液中IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及IL-10水平。结果 Akt抑制剂组与IL-2组TIL数目在抗CD3抗体刺激前(培养第5、10天)、刺激后(培养第15、20、25、30天)比较差异均无统计学意义(P0.05);培养第5、10、15、20、25、30天,Akt抑制剂组中央记忆型T细胞占CD8~+T淋巴细胞比率[(9.57±9.14)%、(13.98±3.92)%、(15.74±2.74)%、(16.05±2.36)%、(19.14±3.55)%、(14.33±3.66)%]均明显高于IL-2组[(9.14±3.06)%、(10.07±3.57)%、(11.10±3.32)%、(11.72±2.87)%、(12.80±4.20)%、(9.61±4.23)%](P0.05);培养第25天,中央记忆型T细胞占CD8~+T细胞比率在Akt抑制剂组、IL-2组均最高;随培养时间延长,2组TIL上清中IL-10、IFN-γ、TNF-α分泌量均逐渐升高,且Akt抑制剂组IFN-γ分泌量自第5天开始明显高于IL-2组(P0.05),TNF-α分泌量在第25天明显高于IL-2组(P0.05),2组不同时间IL-10分泌量比较差异均无统计学意义(P0.05);流式细胞法检测结果显示,培养第25天,Akt抑制剂组分泌IFN-γ的TIL比率[(11.35±0.47)%]明显高于IL-2组[(6.25±0.66)%](P0.05)。结论 Akt抑制剂可提高肝癌组织TIL中中央记忆型T细胞比率,促进TIL分泌IFN-γ,且不影响TIL增殖活性。