IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。     

2017-2021年菏泽地区非结核分枝杆菌菌种分布及耐药性观察

目的 观察2017～2021年菏泽地区非结核分枝杆菌(NTM)菌种分布及耐药性情况。方法 选取2017年1月～2021年12月菏泽地区传染病医院分离出的NTM菌株72株,采取荧光PCR熔解曲线技术进行菌种鉴定,利用微量液体培养基最低抑菌浓度法展开药敏试验。结果 菏泽地区2018年非结核分杆菌的感染率与2017、2016年相比虽有所增高,P>0.05;胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌占比前三位,分别为64.13%、18.48%、5.43%;72例非结核分枝杆菌对常用抗菌药物药敏试验结果显示,NTM对异烟肼耐药率高达100%,脓肿分枝杆菌对8种常用抗菌药物耐药性高达80%以上,其次为龟分枝杆菌耐药性较高。结论 2018年后菏泽地区非结核分枝杆菌菌种分布以上升趋势为主,最为常见菌种为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌,不同NTM菌种在常见7种抗菌药物耐药率上存在差异,而对于常规抗结核药物整体耐药性高。     

26例气囊导尿管相关性尿道损伤的对策与护理体会

留置导尿是临订工作中常用的基本操作，由于其本身为有创介入性操作以及其他多种因素，临床上，气囊导尿管相关性尿道损伤并不少见。我科自2006年12月至2010年2月共收治26例，现将处理对策及护理体会报告如下：     

荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌复合群对利福平和异烟肼耐药性的价值

目的 评价荧光PCR探针熔解曲线法(简称“探针熔解曲线法”)检测结核分枝杆菌复合群对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的价值。方法 从2015年1月至2018年7月山东省菏泽市传染病医院收治的883例肺结核和耐多药结核病(MDR-TB)患者中,选择萋-尼染色结果为阳性的结核病患者的痰标本共215份(例)进行分离培养,对鉴定为结核分枝杆菌复合群(MTBC)的200株(例)菌株同时使用比例法药物敏感性试验(DST)和探针熔解曲线法检测对RFP和INH的耐药性。以DST检测结果为金标准,分析探针熔解曲线法检测RFP和INH的敏感度、特异度、符合率和一致性(Kappa检验)。结果 200株(例)MTBC分离株中,以DST检测结果为标准,探针熔解曲线法检测RFP耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为96.4%(106/110;95%CI:90.7%~98.9%)、80.0%(72/90;95%CI:70.5%~87.1%)和89.0%(178/200);对INH耐药性检测的敏感度、特异度和符合率分别为85.4%(123/144;95%CI:78.6%~90.7%)、96.4%(54/56;95%CI:87.7%~99.6%)和88.5%(177/200)。探针熔解曲线法与DST检测MTBC对RFP耐药性的Kappa值为0.78,对INH耐药性的Kappa值为0.74。结论 探针熔解曲线法检测MTBC对RFP和INH的耐药性均有较高的敏感度和特异度,且探针熔解曲线法与DST检测MTBC对RFP和INH耐药性的一致性较高,有助于对耐药结核病患者的及早发现和治疗。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

浙江省台州市某医院产妇觉察压力与产后抑郁的相关性分析

目的：探讨浙江省台州市某医院产妇觉察压力与产后抑郁的相关性.方法：采用爱丁堡产后抑郁量表和觉察压力量表对288例孕妇进行问卷调查,采用Pearson相关分析法和分层回归分析法探讨觉察压力和产后抑郁的相关性.结果：产妇抑郁评分为（14.66 ±1.67）分,发生率为25.35％;觉察压力总分为（28.42±3.88）分;不同家庭收入、分娩情况、新生儿性别组产妇抑郁评分比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;Pearson相关分析显示,抑郁评分与觉察压力总分（r=0.391,P=0.009）、预测感（r=0.431,P=0.001）、控制感（r=0.342,P=0.030）、超载感（r=0.378,P=0.024）均显著正相关;分层回归分析显示,新生儿性别、家庭收入、觉察压力均为产后抑郁的影响因素.结论：觉察压力在产妇中普遍存在,它是产后抑郁的重要影响因素.     

结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药分析

目的对结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药性进行分析探讨,为今后的临床工作,提供可参考依据。方法选择2015年1月至2017年6月间,我院收治的疑似结核病患者1221例的标本3663份作为研究对象,对其展开涂片镜检、罗氏固体培养、MGIT960液体培养等3种实验室检测,并对检测结果进行统计分析,同时展开药敏分析。结果通过对比发现,涂片镜检所需时间最短(P0.05),但是其检测阳性率最低(P0.05);罗氏固体培养阳性检测时间最长,阳性率高于涂片镜检法(P0.05),低于MGIT960液体培养(P0.05);MGIT960液体培养阳性所需时间较涂片镜检法长(P0.05),较罗氏固体培养法短(P0.05),阳性率最高(P0.05)。结核分支杆菌对吡嗪酰胺具有较高的耐药性。结论在对结核分支杆菌进行实验室检测的过程中,MGIT960液体培养所需时间相对较短,阳性率最高,在今后的实验室检测中,值得对其给予足够重视。结核分支杆菌对常用抗结核药物存在一定耐药性,值得关注。     

IL-1β反义RNA表达载体的构建及对肝癌细胞中IL-1β水平的影响

目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体，观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增IL-1β1和IL—1β2，将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，构建Pafp IRES2-antilIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体，利用jetPEI转染H22肝癌细胞和YAC-1淋巴细胞，荧光显微镜下观察反义RNA载体的表达，RT—PCR方法分析H22细胞中IL-1β表达水平的变化。结果RT—PCR扩增到两条长度分别为264和284bp的片段，与IL-1β1和IL—1β2相符，将其反向与Pafp IRES2-EGFP连接，经菌落PCR和DNA序列分析证实，获得了PafpIRES2-antiIL-1β1和Pafp IRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体。上述载体转染H22细胞后，荧光显微镜下可见细胞表达出明亮绿色荧光，而YAC-1细胞则未见荧光。RT—PCR分析证实转染反义RNA后H22细胞中IL-1β表达水平明显下降，尤以IL-1β2反义RNA的阻断效果更为显著。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌细胞特异性反义RNA表达载体PafpIRES2-antiIL-1β1，PafpIRES2-antiIL—1β2，两载体能有效地阻断肝癌细胞中IL-1β的表达。     

小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的：重组表达小鼠IL-1β全长基因，转染H22肝癌细胞，分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法：构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β，利用jetPEI转染H22肝癌细胞，RT—PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达，MTT方法分析转染前后，野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果：RT—PCR扩增出小鼠IL-1β，长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EGFP同时经Xho I和EcoR I双酶切，在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌，提取质粒经PCR、限制性酶谱分析（XhoI＋EcoRI）和DNA序列测定后，确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中，RT—PCR和荧光观察证实，H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体，与转染空载体的对照组细胞相比，IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强，同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降，效靶比40：1时下降了约10％。结论：IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性，可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。     

肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1a反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制.方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1a反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定.反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1a1组、H22/antiIL-1a2三组,RT-PCR检测IL-1a的表达水平.以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性.结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1a反义RNA的表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,转染H22细胞后细胞中IL-1a表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1a2更为显著.成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比, H22/antiIL-1a2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05). H22/antiIL-1a1、H22/antiIL-1a2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01).结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1a表达、上调NK细胞的杀伤活性有关.