猪急性腹泻综合征病毒N基因多克隆抗体的制备及其生物信息学分析北大核心CSCD

目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA柱纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用生物信息学软件对SADS-CoV N蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及B淋巴细胞与T淋巴细胞抗原表位进行预测。结果重组菌在37℃经1mmol/L IPTG诱导表达分子质量为48 ku的目的蛋白,与预期N蛋白分子质量相符。用该蛋白免疫小鼠,制备的抗N蛋白多克隆抗体的效价可达1︰200000;经IFA、Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能够特异性识别SADS-CoV感染猴肾细胞(Vero)表达的N蛋白,具有较高的抗体效价及特异性。生物信息学分析SADS-CoV N由375个氨基酸组成,分子质量为41.636 ku,等电点为9.90;N蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构;螺旋和无规则卷曲是N蛋白二级结构中主要的蛋白质元件;N蛋白存在9个潜在的B细胞表位,第127-135位、134-142位、275-283位可能存在T细胞表位。结论成功构建pColdⅡ-SADS-CoV-N重组质粒,用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得高效的特异抗体血清。生物信息学预测SADS-CoV N含有丰富的螺旋和无规则卷曲结构,以及B、T淋巴细胞抗原表位,为揭示SADS-CoV N蛋白的功能及SADS-CoV相关的转录机制奠定了基础。     

携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用

目的： 探讨携带凋亡素基因（Apoptin）和进行性增量基因3（progression-elevated gene 3, PEG3）启动子的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌的体内、外抑制效果。方法： 以Ad-Apoptin-PEG3p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock（均为前期工作构建）分别感染人结直肠癌SW1116细胞和胃黏膜上皮GES细胞,MTT法检测感染后细胞的增殖水平; 流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用DCFH-DA和Rho123染色流式细胞术分别检测细胞活性氧水平和线粒体膜电位,Western blotting检测细胞色素C的释放。建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,观察Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌皮下移植瘤的抑制作用。结果： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a抑制SW1116细胞增殖,并具有一定的剂效和时效关系,以MOI=100感染72 h后抑制率达到（56.23±664）%,其抑制能力明显强于Ad-pEG3p-E1a和Ad-Apoptin等对照组（均P<0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a感染导致SW1116细胞活性氧水平上调、线粒体膜电位下降以及细胞色素C释放增加,最终诱导SW1116细胞凋亡,凋亡率为（37.97±3.78）%,但对正常GES细胞的上述各项指标均无明显影响。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长（P<0.05）;有效延长模型动物平均生存期,Ad-Apoptin-PEG3p-E1a治疗组平均生存期为（41.0±0.7）d,显著高于Ad-PEG3p-E1a的（34.4±1.6）d、Ad-Apoptin的（33.2±1.2）d和Ad-mock的（28.4±14）d （均P<0.05）。结论： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a可以特异性有效抑制结直肠癌细胞增殖及皮下移植瘤的生长。