抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析

目的：构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体（scFv）基因的酵母表达载体，实现目的蛋白的分泌性表达，并检测其生物活性。方法：采用基因工程和重组DNA技术，从质粒pET28．scFv中切下目的基因片段，定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点，构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。Bgl Ⅱ线性化后，电转化入受体酵母菌GS115中，筛选阳性重组子，进行甲醇诱导表达，并用RT-PCR、SDS—PAGE、双抗体夹心Dot—ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果：通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌，RT—PCR、SDS—PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达，表达量可占培养液上清总蛋白量的18％，双抗体夹心Dot-ELISA法检测，表达产物能够特异识别重组HIV-1 gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应。证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论：成功地实现了scFv基因的分泌性表达，为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.     

基于SFV RNA复制子核酸疫苗pIRSFV-HN的构建及其体内外抑瘤作用

目的：构建基于塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN，并探讨其体内外的抑瘤作用。方法：基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因构建核酸疫苗pIRSFV-HN，pIRSFV-HN转染人结肠癌细胞HCT-116，以Western blotting检测转染后HCT-116细胞HN的表达水平，以AO／EB双荧光染色检测肿瘤细胞的凋亡，以MTT法检测疫苗对HCT-116细胞增殖的抑制。构建C57BL／6小鼠右后肢皮下荷H22腹水瘤细胞模型，瘤体内注射pIRSFV-HN（共3次），检测该小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平和特异性CTL活性。结果：成功构建基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN。结肠癌细胞HCT-116被疫苗转染后可有效表达HN蛋白，对照细胞则无表达；转染后HCT-116细胞出现凋亡的征象；该细胞的增殖受到明显抑制，最大抑制率达55．34％。移植瘤体内注射疫苗后，荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-1水平显著升高（P〈0．05），其CTL活性也显著升高（P〈0．01）。结论：基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN在体外可有效地抑制肿瘤细胞；在体内可促使免疫趋向Th1优势，提高其抑瘤免疫水平。