乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子变异检测方法的比较研究

目的 建立错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（mPCR-RFLP）检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区A1896、基本核心启动子（BCP）T1762/A1764双变异的方法,与直接测序法比较,评估其应用价值.方法 利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194 bp、C启动子区长184 bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶Bsu36I、BclI酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前C A1896、BCP T1762/A1764双变异的方法,对127份HBsAg、HBV DNA阳性的HBV感染者血清进行分析,酶切同时测序.2份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异株、野株混合感染的准确性.结果 127份血清中125（98.42%）份能用酶切、121（95.21%）份能用测序分析HBV前CA1896、BCP T1762/A1764状况.酶切与测序均成功的119份血清中,16份为前C区A1896变异株,34份为BCP T1762/A1764双变异株,21份为前C区A1896、BCP T1762/A1764联合变异株,48份为前C区G1896、BCP A1762/G1764野株,酶切与测序的结果完全一致.1份酶切鉴定为前C区A1896、G1896混合感染标本的5个克隆子中,1个为前C区A1896变异株,另外4个为前C区G1896野株;另1份酶切鉴定为单纯前C区A1896变异标本的5个克隆子均为前C区A1896变异株,酶切分析结果与克隆测序结果完全相符.结论 与测序法相比,本方法较简便、特异性强,能区分野毒株、变异株混合感染,适合较大样本分析,可用于流行病学调查及临床筛查.     

132例乙型肝炎病毒感染者基本核心启动子变异分析

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）感染者基本核心启动子（BCP）变异情况。方法收集HBV感染者血清标本132份(HBV DNA均阳性),用半巢式聚合酶链反应扩增HBV C基因部分片段,产物纯化后直接测序,检测BCP T1762/A1764变异。用S基因错配聚合酶链反应（PCR RFLP）法确定HBV基因型。结果51例乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性患者BCP T1762/A1764双变异检出率为27.45%,81例HBeAg阴性患者BCP T1762/A1764双变异检出率为62.96%,两组比较,差异有高度显著性（χ2=15.79,P＝0.00）。 BCP T1762/A1764双变异的HBV感染者B基因型检出率为33.85%,明显低于C基因型的检出率66.15%（χ2=24.25,P＝0.00）。结论HBV感染者普遍存在BCP T1762/A1764双变异,以C基因型感染者多见。     

贵州省四城市乙型肝炎病毒感染者病毒基因型调查研究

目的 调查贵州省4城市乙型肝炎病毒（HBV）感染者的病毒基因型及其与临床的关系。方法 选择贵阳、遵义、凯里、都匀4城市慢性HBV感染患者共786例，其中无症状携带者（ASC）346例，慢性肝炎（CH）313例，肝硬化（LC）77例，肝细胞肝癌（HCC）50例。用S基因限制性片段长度多态性确定基因型，直接测序分析B基因亚型，比较主要基因型地区分布及临床特征。结果 786例中，B基因型497例（63．23％），C型275例（34．99％），A型7例（0．89％），D型7例（0．89％），未发现E、F型。B型的分布：凯里市最高（96．04％），遵义、都匀市其次（78．79％、64．52％），贵阳市最低（53．14％）。C型的分布，贵阳（45．84％）高于都匀（34．41％）、遵义（13．13％）及凯里市（3．96％），差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。94例B型感染者中，93例为Ba（98．94％）、1例为目亚型。从ASC、CH、LC到HCC组，B型的分布逐渐降低，而C型在各组的分布逐渐增高。与B型相比，C型感染者年龄较大；ALT水平较高（P〈0．05）；HBeAg阳性较低（P〈0．025）。结论 贵州省存在A、B、C、D4种HBV基因型，但以B型为主，C型其次，A、D型极少。B型中又以Ba亚型为主。B、C基因型在贵州省4城市的分布有一定差异。     

刀豆球蛋白A所致实验性肝损伤模型的构建

目的 建立刀豆球蛋白A（ConA）诱导小鼠实验性肝损伤的模型。方法Balb／C小鼠40只，分别尾静脉注射ConA，根据注射剂量，小鼠被随机分为4组（每组10只）：A组10mg／kg；B组20mg／kg；C组30mg／k；另设D组作为实验对照组，尾静脉仅注射生理盐水。给药后8h观察小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）活性、死亡率和肝组织的病理改变。选择最佳ConA剂量，观察此剂量下不同时间点ALT活性、死亡率和肝组织的病理改变特点。结果经ConA处理后8h，A组与D组无小鼠死亡，B组死亡3只，C组小鼠全部死亡；各组血清AJJ值：A组为（215．55±70．19）IU／L，B组为（2516．14±764．69）IU／L，均显著高于对照组D组的（57．30±12．21）IU／L（分别t=-8．466、t=10．143，均P=0．000）。光镜下，A组可见肝细胞变性；B组和C组可见肝组织炎症细胞浸润和肝细胞变性、坏死，以C组为甚。20mg／kg Con A尾静脉注射，小鼠死亡率、ALT活性、肝组织炎症细胞浸润和肝细胞变性、坏死在一定时间范围内（24h）随时间增加而加剧。结论ConA小鼠实验性肝损伤模型建立，ConA剂量以20mg／kg、观察时间以8h为宜。     

贵州乙型肝炎病毒基因型分布及意义分析

目的调查贵州乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布。方法选择贵阳、遵义、凯里、都匀慢性HBV感染者693例，其中无症状携带者（ASC）292例，慢性肝炎（CH）276例，肝硬化（LC）76例，肝细胞肝癌（HCC）49例。用S基因限制性片段长度多态性确定基因型，比较主要基因型的地区分布及其与临床的关系。结果693例中，B基因449例（64．79％），C型233例（33．62％），A型6例（0．87％）。D型5例（0．72％），未发现E、F基因型。B型的分布：凯里最高（96．40％），遵义、都匀其次（78．79％、76．19％），贵阳最低（53．66％）。C型的分布，贵阳（45．68％）高于都匀（23．80％）、遵义（13．13％）及凯里（3．96％），差异有统计学意义（P≤0．01）。与B型相比，C型感染者平均年龄大；ALT水平高；HBeAg阳性率低（P≤0．01）。除ASC组外，B、C2种基因型在CH、LC和HCC中的分布差异有统计学意义（P均〈0．01）。结论贵州存在A、B、C、D4种HBV基因型，但以B型为主，C型其次，A型、D型仅占很小比例。B、C基因型在贵州不同地区的分布有一定差异。与B型相比，C型感染者肝脏损害的程度较重。     

两种实验方法检测乙型肝炎病毒前C区A1896变异的比较研究

目的建立错配PCR-限制性片段长度多态性(mPCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区A1896变异的方法,与直接测序法比较,评估其应用价值。方法利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194bp的基因片段,扩增产物经限制性内切酶Bsu36I酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前CA1896变异的方法,对134份乙肝患者血清进行分析,酶切同时测序。2份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异株、野株混合感染的准确性。结果134份血清中117(87.31%)份能用酶切、109(81.34%)份能用测序成功分析HBV前CA1896状况。酶切与测序均成功的101份血清中,54份为前C区A1896变异株,47份为前C区G1896野株,酶切与测序的结果完全一致。1份酶切鉴定为单纯前C区A1896变异株的5个克隆子均为前C区A1896变异株;1份酶切鉴定为混合感染标本的5个克隆子中,1个为前C区A1896变异株,另外4个为前C区G1896野株。酶切分析结果与克隆测序结果完全相符。结论与测序法相比,本方法简便、特异性强,能鉴定混合感染,适合大样本分析,可用于临床及流行病学调查。     

乙型肝炎病毒前S基因变异与肝病进展的关系

目的探讨HBV前S基因变异与疾病进展的关系。方法收集无症状携带者（ASC）、慢性肝炎（CH）、肝炎肝硬化（LC）、肝细胞癌（HCC）患者血清138份，PCR扩增前S区基因．聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测前S2起始码变异，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析前S缺失变异，直接测序确定前CA1896、基本核心启动子（BCP）T1762／A1764变异。数据行X^2检验。结果HCC、LC组前S缺失变异检出率分别为56．3％和42．9％，高于CH组的11．8％和ASC组的8．1％（P〈0．01）。前S2起始码变异检出率在HCC（50．0％）、LC（37．1％）组亦较CH（5．9％）、ASC（0）组高。前S缺失、前S2起始码变异在HBeAg阴性组的检出率分别为37．5％和36．1％，高于HBeAg阳性组的19．7％和7．6％（P〈0．01）。分析前S基因、T1762／A1764、A1896单独或联合变异在HCC、LC组和CH、ASC组的分布，Fisher精确检验表明，T1762／A1764和前S基因的联合变异是影响疾病进展、导致严重肝病的重要因素（P-0）。结论严重肝病患者前s基因变异发生率高，有T1762／A1764联合前S基因变异HBV感染者的肝病易进展。     

贵州省乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子变异分布

目的调查贵州省乙型肝炎病毒(HBV)前C区A1896、基本核心启动子区(BCP) T1762/A1764变异分布。方法收集贵阳、遵义、凯里、都匀4地区不同民族无症状携带者(ASC)、慢性肝炎(CH)、肝炎肝硬化(LC)、肝细胞肝癌(HCC)患者血清482份,用测序及限制性片段长度多态性检测A1896、T1762/A1764变异,用S基因PCR-RFLP确定基因型。结果A1896、T1762/A1764变异检出率分别为23.03%和29.67%。汉族感染者A1896、T1762/A1764变异检出率为27.64%和36.04%,高于侗、苗、布依族感染者合并后的7.96%、8.85%(P<0.01)。A1896变异在B、C基因型中的分布为20.34%和27.13%(P>0.05),T1762/A1764变异为18.97%和46.28%(P<0.01)。A1896、T1762/A1764变异在HBeAg阴、阳性组间的分布差异有统计学意义(P值均<0.01)。从ASC到HCC组,A1896、T1762/A1764变异分布逐渐增高,LC、HCC组的检出率明显高于CH和ASC组(P值均<0.01)。A1896、T1762/A1764变异的分布:贵阳(分别为31.79%和41.06%)高于遵义(10.94%和14.06%)、都匀(8.64%和11.1I%)及凯里(2.86%和2.86%),但多因素logistic回归分析在控制了HBeAg、HBV基因型及临床类型影响后,在地区间分布差异无统计学意义。结论A1896、T1762/A1764变异在贵州省不同民族间分布有一定差异。C型感染者易发生T1762/A1764变异,两种变异均与疾病进展有关。     

乙型肝炎病毒1653T变异与肝癌相关性研究

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）1653T变异与肝癌的相关性。方法收集HBV感染者血清119份（HBV DNA均阳性，其中 HBV携带24份,慢性乙型肝炎35份,乙型肝炎肝硬化29份,原发性肝癌31份），采用半巢式聚合酶链反应扩增HBV 前C及C基因部分片段，产物纯化后直接测序，检测1653T变异；用S基因PCR RFLP方法确定HBV基因型。结果24份HBV携带者标本未检出1653T变异；35份慢性乙型肝炎患者标本中检出1份（2.86%）1653T变异；29份乙型肝炎肝硬化患者标本中检出5份（17.24%）1653T变异，与慢性乙型肝炎患者比较，差异无统计学意义（χ2=2.36, P>0.05）；31份原发性肝癌患者标本中检出14份（45.16%）1653T变异，与乙型肝炎肝硬化患者比较，差异有统计学意义（χ2=5.40, P＜0.05）。119份血清标本中有10份未能成功定型；余51份B基因型标本中检出2份1653T变异，58份C基因型标本中检出18份1653T变异，两者比较，差异有统计学意义（χ2=11.57，P＜0.01)。结论HBV 1653T变异与原发性肝癌关系密切，更易发生在C基因型；可作为预测原发性肝癌的指标。     

贵州地区慢性乙型肝炎病毒感染者病毒基因亚型研究

目的调查贵州省B、C基因型慢性HBV感染者的病毒基因亚型。方法PCR扩增HBV P区长309 bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶NciⅠ、VspⅠ、BstEⅡ酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,用限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）检测HBV C基因亚型。直接测序确定B基因亚型、对178例用S基因限制性片段长度多态性鉴定为B、C基因型的不同临床类型慢性HBV感染者进行亚型分析。结果84例C基因型HBV感染者中,27例（32.14%）为C1亚型、56例（66.67%）为C2亚型,1例为C1、C2亚型混合感染。94例B基因型HBV感染者中,93例（98.94%）为Ba、1例为Bj亚型感染。从无症状乙型肝炎表面抗原携带者、CHB到肝硬化/肝癌,C1亚型在各组中的比例逐渐降低,分别为60.00%、30.65%和16.67%;而C2亚型在各对应组中的分布逐渐增高,分别为40.00%、67.74%和83.33%。结论贵州地区B、C基因型慢性HBV感染者中,以Ba、C2亚型为主。C1、C2亚型在疾病中的分布有一定差异。PCR-RFLP分析HBV C1、C2亚型,方法简便、特异性强,适合较大样本分析,可用于流行病学调查。